Этапы исследования структуры белка:
1) Выделение белка из смеси в чистом виде.
2) Определение N-концевой аминокислоты.
3) Определение С-концевой аминокислоты.
4) Определение аминокислотной последовательности.
Методы разделения смеси белков
1) Диализ (метод мембранных сил).
Для этого используют полуроницаемые мембраны (целлофан, целлюлоза), диаметр пор которых варьирует в широких пределах.
2) Гель-хроматография.
Используеься гель с порами. Белки с маленьким размером заходят в поры, и скорость их прохождения больше.
3) Аффинная хроматография.
Основана на высоком сродстве белков к специфическим группам и молекулам. Колонка для аффинной хроматографии заполняется твёрдым носителем, поверхность которого содержит вещества, способные специфически связываться с анализируемыми белками (например, белок лектин связывается с глюкозой).
4) Ионно-обменная хроматография.
Каждый белок имеет определённый заряд - положительный или отрицательный при определённом рН. Это свойство и лежит в основе ионной хроматографии. Для этого используют целлюлозу, которая заряжена либо отрицательно (катионный обменник), либо положительно (анионный обменник). Белки, которые имеют противоположный заряд по отношению к целлюлозе, сохраняются при прохождении раствора белков через колонку. Потом их отсоединяют с помощью элюентов.
5) Адсорбционная хроматография.
Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твёрдых адсорбентов. В качестве адсорбентов используют:
-активированный древесный уголь;
-гель фосфата кальция;
-оксид аллюминия;
-оксид кремния;
6) Распределительная хроматография.
Твёрдый носитель играет роль опоры для передвигающего с разной скоростью белка. Носители - силикагель, крахмал, плёнки.
7) Ультрацентрифугирование.
8) Электрофорез (смотри методичку А.Д.Тагановича "Нуклеопротеины").
9) Изоэлектрофокусирование.
Основано на проведение электрофореза в средах с градиентом рН. При этом точное месторасположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки.
Определение N-концевой аминокислоты
Перед тем, как определять последовательность аминокислот в белке, необходимо удалить дисульфидные связи внутри пептидов и между другими пептидами. Для этого используют 2-меркаптоэтанол или дитиотреитол. Чтобы предотвратить обратное образование дисульфидных связей, белок надо обработать йодацетатной кислотой (алкилирует свободные сульфогидрильные радикалы).
Методы:
1) Метод Сенжера. Для этого используют 1-фтор-2,4-динитробензол (ФДНБ), который взаимодействует с N-концевой аминокислотой в щелочных условиях. Такая аминокислота может быть отщеплена от белка и идентифицирована, т.к. имеет жёлтый цвет. Затем проводят электрофорез и сравнивают искомую аминокислоту со стандартами.
2) Даксил-хлорид. Как и ФДНБ, даксил-хлорид взаимодействует с N-концевой аминокислотой в щелочных условиях. Анализ как по методу Сенжера, только даксилированные аминокислоты определяют посредством флюоресценции.
3) Метод деградации Эдмана. При использовании этого метода аминокислотная последовательность в белке остаётся невредимой. Это имеет преимущество перед предыдующими методами, т.к. можно определить всю последовательность аминокислот в белке. При этом методе используют фенилизотиоционат (ФИТЦ).
Определение С-концевой аминокислоты
1) Метод Акабори. Используется гидразин. Он расщепляет пептидные связи, не нарушая последовательность а-т в пептиде. Эту а-ту определяют с помощью ФДНБ.
2) Ферментативные методы. Используются карбоксипептидазы, которые осуществляют разрыв пептидной связи с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа. Это приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.
Определение аминокислотной последовательности
Для этого сначала проводят избирательный (частичный) (химический или ферментативный) гидролиз пептида на олигопептиды, последовательность а-т в которых может быть точно определена.
Химические методы избирательного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный распад пептидных связей, образованных определёнными а-тами, оставляя незатронутыми другие связи:
-бромциан (по остаткам метионина);
-гидроксиамин (между аспаргиновой кислотой и глицином);
-N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана).
Ферментативные методы - основаны на избирательном действии протеолитических ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определёнными а-тами:
-пепсин (фен-тир-глу);
-химотрипсин (три-тир-фен);
-папаин, субтилизин и др.
Метод пептидных карт (метод отпечатков пальцев, метод Ингрена).
Используется при определении сходства и различий гомологических белков по первичной структуре.
Гомологические белки - это белки, которые выполняют одну и ту же функцию, но различаются по структуре (норма и патология, локализованные в разных органах).
Этапы:
- оба белка (например от здорового и больного человека) расщепляют на пептиды с помощью пепсина, трипсина.
-затем смесь пептидов наносят в виде пятна на угол листа фильтровальной бумаги.
- проводят электрофорез в горизонтальном направлении и хроматографию в вертикальном.
-полученные карты (их две) сравнивают.
Этим методом определяется серповидно-клеточная анемия (глу - вал).
Пептидные карты трипсиновых пептидов гемоглобина А и гемоглобина S. На карте гемоглобина S смещено положение всего одного пептида (показанного красным цветом, содержащего генетически измененную аминокислоту.
