Поглощение и люминесценция биомолекул

2.1.8.1. Поглощение биомолекул. Принцип Франка-Кондона

При поглощении света действует принцип Франка-Кондона: за короткое время перехода в возбужденное состояние (порядка 10^-15 с, включая кванты видимого света) ядра не успевают изменить своего положения в пространстве. Это время малό по сравнению с периодом колебаний большинства молекул (порядка 10^-13 с), следовательно, за время поглощения фотона ядра сохраняют как положение в пространстве, так и кинетическую энергию.

Поглощение света веществом зависит не только от его концентрации по закону Бугера-Ламберта-Бера, но и от состояния поляризации падающего пучка света — дихроизм поглощения. Причина дихроизма — анизотропное строение поглощающего вещества (упорядоченное расположение молекул вещества). Различная степень упорядоченности может вызвать неодинаковое поглощение при сохранении количества вещества. Например, молекулы нуклеиновых кис-лот (НК) в волокнах или пленках обладают собственным дихроизмом, который может достигать 60%. Это связано с тем, что пуриновые и пиримидиновые основания, ответственные за поглощение нуклеиновых кислот в области 260 нм, жестко ориентированы по всему полинуклеотиду и располагаются в плоскостях, перпендикулярных длинной оси молекулы НК. В соответствии с этим наибольшее поглощение наблюдается для света, плоскость колебаний которого перпендикулярна оси молекулы, а наименьшее — для колебаний, совпадающих с направлением оси. Большинство биологически важных молекул оптически анизотропны, и некоторую степень ориентации имеют почти все цитологические структуры. Поэтому эффект дихроизма может служить средством для изучения упорядоченности молекул в биологических системах.

Илья Михайлович Франк (1908-1990) Советский физик, академик (1968). Директор Лаборатории нейтронной физики ОИЯИ в г. Дубне (с 1957), зав. лабораторией ИЯИ АН СССР (с 1971). Профессор МГУ им. М.В. Ломоносова (с 1940). Труды в области физической оптики, нейтронной и ядерной физики низких энергий. Разработал совместно с И.Е. Таммом теорию излучения Вавилова-Черенкова, за что удостоен Нобелевской премии (1958, совместно с И.Е. Таммом и П.А. Черенковым). Создал школу физиков. Лауреат Государственной премии СССР (1954, 1971). Награжден Золотой медалью С.И. Вавилова (1980).

Эдвард Кондон (1902-1974) Американский физик, член Национальной АН (1944). Автор работ по квантовой механике, атомной и ядерной физике, молекулярной спектроскопии, теории твердого тела. Член ряда иностранных академий и научных обществ.

Некоторые следствия основных положений квантовой механики лежат в основе спектрального анализа:

1) дискретность уровней энергии;

2) различные «расстояния» (ΔE) между энергетическими уровнями электронов в атоме;

3) различная вероятность переходов между различными энергетическими уровнями;

4) специфичность и индивидуальность спектров атомов тех или иных элементов.

По спектру можно легко узнать атом, сравнивая спектр исследуемого вещества со спектрами эталонных источников и идентифицируя те или иные линии.

При этом электронные спектры могут совпадать для широкого круга родственных соединений, полная же картина колебательного спектра со всеми пиками и изгибами не повторяется даже у очень похожих веществ.

Типичные молекулярные спектры – полосатые, они наблюдаются в виде совокупности узких полос в УФ, видимой и ближней ИК области. В конденсированных средах вследствие взаимодействия молекул отдельные полосы накладываются друг на друга и образуется сплошной спектр.

Обратимся к конкретным примерам биомолекул. Собственным поглощением в видимой области обладают такие биомолекулы, как гемоглобин (самая сильная полоса поглощения в районе 400 нм, получившая название полосы Соре), меланин, липофусцин, родопсин, цитохром, хлорофилл и др. В области УФ поглощают НК, белки, свободные нуклеотиды, лигнин, некоторые витамины, гормоны. Однако спектр поглощения клетки определяется почти исключительно НК и белками, так как прочие соединения встречаются в ничтожных концентрациях. Для белков максимум поглощения приходится на l_mах» 280 нм. Показатель поглощения белков в 10-30 раз меньше, чем у НК. Излучение в организме поглощается также кислородом, а в дальней ИК области (от 3 до 1000 мкм) — молекулами воды, кислорода и СО₂. Поглощение молекул в ИК области связано с колебаниями функциональных групп или связей в молекулах –ОН, –NH₂, –NO₂, =O, –С, –N и др. Собственное поглощение различных молекул клетки ведёт к отклонениям от закона Бугера-Ламберта-Бера.

Пропускание биотканями когерентного (лазерного) излучения тоже имеет свои особенности. Распределение интенсивности проникновения излучения на глубину имеет отклонение от закона экспоненциального распределения ввиду разной плотности «упаковки» клеток и многократного переотражения. Поляризованное излучение поглощается, вообще говоря, менее активно, чем неполяризованное, но этот эффект в большинстве случаев выражен слабо. В ряде экспериментов установлено, что при прохождении через образцы различных тканей с толщиной, превышающей глубину проникновения, лазерное излучение не сохраняет когерентности и поляризованности. Следовательно, в глубине ткани излучение лазерного источника действует наподобие обычного неполяризованного и некогерентного излучения в соответствующей спектральной области. Однако это не означает, что когерентность никак не сказывается на взаимодействии излучения с биотканью. Во-первых, диффузно отраженное излучение имеет спекл-структуру, что свидетельствует о сохранении когерентности, во-вторых, в процессе распространения внутрь ткани и соответственно потери когерентности при переизлучении образуются пространственно неоднородные зоны взаимодействия, что можно рассматривать как «след» когерентности с соответствующими вторичными эффектами.

Величина поглощенной участком биоткани энергии лазерного излучения с учетом его оптических свойств может быть оценена по формуле:

                                         (2.7)

где E_п — плотность поглощенной энергии, Дж/м²; Р _E — мощность падающего излучения (Вт); t — время воздействия (с); S — площадь облучения (м²); r* — коэффициент отражения участка облучаемой биоткани; t* — коэффициент пропускания участка облучаемой биоткани.

 

2.1.8.2. Люминесценция биомолекул: основные параметры

и использование в диагностике

Слово «люминесценция» объединяет совокупность явлений, завершающихся излучательным переходом молекулы из возбужденного в основное состояние. Такой переход, как правило, является термодинамически неравновесным, и поэтому люминесценция часто именуется как «избыточное над тепловым» излучение.

Учитывая особое значение люминесцентных методов анализа для медицины и биологии, остановимся несколько подробнее на определении люминесценции как физического явления. Определение, упомянутое выше, было введено Г. Видеманом.

Густав Генрих Видеман (1826-1899) Немецкий физик, член-корр. Берлинской Академии наук (1879). Профессор Базельского университета (Швейцария) с 1854. Профессор Лейпцигского университета с 1871. Работы по электричеству, магнетизму, теплоте, оптике. Основатель Берлинского физического общества, редактор журнала «Анналы физики и химии». Член-корр. Петербургской АН (1883)

Однако в дальнейшем оно было дополнено С.И. Вавиловым с целью отличия люминесценции от более кратковременных явлений вторичного излучения — отражения и рассеяния, тормозного излучения заряженных частиц, излучения Вавилова-Черенкова и т.п. В настоящее время под люминесценцией принято понимать избыточное над тепловым излучение, происходящее после прекращения внешнего воздействия в течение времени, значительно превышающего период колебаний в электромагнитной волне оптического диапазона.

 

Добавленный Вавиловым критерий длительности не определен, тем не менее, вполне жестко и может служить только для общей ориентировки. Это не единственное замечание, которое следует добавить к принятому определению люминесценции. Так, данное определение молчаливо предполагает, что люминесценция — макроскопическое явление, поскольку проводится сопоставление с тепловым излучением. Действительно, поскольку температура — понятие, имеющее смысл только для больших коллективов частиц, причем находящихся в равновесном состоянии, разделение излучения на тепловую и люминесцентную компоненты бессмысленно для отдельных молекул и атомов. Данное определение некорректно и для больших коллективов частиц, но находящихся в неравновесном состоянии, так что теряют смысл как тепловое излучение, так и люминесценция. По указанным причинам крайне не строго употреблять термин «люминесценция» для разреженных газов, для которых длина свободного пробега частиц сравнима с размерами сосуда, в котором газ находится, в особенности, если речь идет о резонансном взаимодействии излучения с веществом. Здесь гораздо предпочтительнее использовать термин «резонансное излучение», а для отдельных атомов или молекул — излучение атомного (молекулярного) перехода между квантовыми состояниями. С определенными натяжками термин «резонансная люминесценция» оправдан только для достаточно плотных газов и для конденсированных сред, но и здесь он по сути дела не имеет смысла, если рассматриваются неравновесные состояния (например, активные среды лазеров).

Существенно отметить, что люминесценция носит принципиально квантовый характер. С этой точки зрения становится понятным введенное Вавиловым дополнение к определению Видемана: пребывание вещества в возбужденном состоянии, предшествующее излучательному переходу, может продолжаться в течение достаточно длительного времени, заведомо превышающего время первичного взаимодействия на уровне фотонов.

Поскольку излучательный переход может происходить по разным причинам, люминесценцию, представляющую интерес для биологии и медицины, принято классифицировать согласно схеме, приведенной на рис. 2.7.

Люминесценция

 

Хемилюминесценция                    Флуоресценция                Фосфоресценция

Рис. 2.7. Виды люминесценции

Напомним, что хемилюминесценция обусловлена преобразованием энергии химических процессов в излучение. Нас в данном случае интересует биолюминесценция, т.е. разновидность хемилюминесценции, представляющая собой те виды люминесценции живых тканей, которые не связаны с воздействием на них какой-либо внешней энергии излучения. Биолюминесценция обусловлена определенными химическими процессами, протекающими в живых клетках, и, к примеру, сопровождает образование свободных радикалов. Биолюминесцентные тесты используются в качестве индикаторов определенных биохимических реакций.

Биолюминесцентное излучение может захватывать как ультрафиолетовую, так и видимую область спектра. В природе преобладает биолюминесценция в желто-зеленой области, отчетливо выраженная у микроорганизмов, беспозвоночных, глубоководных рыб. Теплокровные обладают весьма слабой по сравнению с другими представителями флоры и фауны биолюминесценцией, и это является источником диагностической информации (увеличение фона биолюминесценции тканей означает наличие патологии). Для количественного анализа биолюминесценции необходимы чувствительные приборы, способные измерять интенсивность излучения на уровне отдельных квантов. Видимый свет подавляет биолюминесценцию клеток, что было изучено еще С.И. Вавиловым, высказавшим ряд весьма плодотворных идей касательно изучения люминесценции.

Два других вида люминесценции представляют собой фотолюминес-ценцию — переизлучение предварительно поглощенного света.

Флуоресценция и фосфоресценция обусловлены переходами внешних валентных электронов. Именно эти электроны ответственны за химические связи, поэтому люминесцентный анализ исключительно информативен для изучения динамики молекулярных структур.

Временной диапазон между поглощением излучения и его последующим испусканием достаточен для протекания целого ряда процессов, каждый из которых ведёт к изменению наблюдаемой характеристики флуоресценции. К таким процессам относятся: столкновения с молекулами тушителя флуоресценции (например, О₂), вращательная и поступательная диффузия, образование комплексов с растворителем или растворёнными веществами и т.д.

Перечислим основные параметры флуоресценции:

1) интенсивность флуоресценции — число излучаемых фотонов dN _фл в полосе d l_фл на длине волны l_фл при данной интенсивности возбуждения:

I _фл = dN _фл / d l_фл;

2) спектр возбуждения — зависимость интенсивности флуоресценции I _фл на длине волны l_фл от длины волны возбуждающего излучения l_в:

I _фл(l_в) = dN _фл / d l_в;l_фл = const.

Спектр возбуждения подобен спектру поглощения, и его изучение позво-ляет ответить на вопрос, какая длина волны возбуждения l_в вызывает наиболее интенсивную флуоресценцию, а также, если в растворе находится набор флуоресцирующих молекул, какому именно флуорофору отвечает данная l_фл.

3) спектр флуоресценции — зависимость интенсивности флуоресценции I _фл при данной длине волны возбуждения l_в от длины волны флуоресценции l_фл:

I _фл(l_в) = dN _фл / d l_фл; l_в = const,

т.е. распределение интенсивности излучаемого света по частотам (длинам волн).

Согласно правилу Стокса, максимум в спектре люминесценции всегда сдвинут в сторону длинных волн по отношению к спектру поглощения, порождающему люминесценцию (см. Л1). Это легко объяснить, придерживаясь приближения Борна-Оппенгеймера (см. Л1) и представив полную энергию молекулы в виде суммы

E = E_эл + E_кол + E_вр,

представляющую собой сложение энергии движения электронов в разрешенных состояниях, энергии колебаний атомов в молекуле и энергии вращения моле-кулы как целого. Спектры люминесценции определяются только электронной составляющей полной энергии, тогда как поглощенная энергия распределяется между всеми тремя составляющими. Если квант возбуждающего излучения переводит систему из основного состояния  на возбужденный уровень , то . При обратном возвращении системы на прежний уровень  частота испускаемого излучения будет , а потому . Система может вернуться с уровня  не в основное состояние , а на уровень, лежащий несколько выше. Тогда тем более .

Заметим, что правило Стокса допускает исключения, почему и носит название правила, а не закона. В самом деле, допустим, что возбуждающий квант переводит систему с какого-то возбужденного уровня на вышележащий уровень . Тогда, конечно, . Но так как > , то может случиться, что > . В этом случае при возвращении системы на основной (невозмущенный) уровень  будет испускаться квант с частотой > .

В принципе знание спектров поглощения и испускания позволяет полностью описать процесс, но на практике эта задача очень трудно разрешима. Как уже указывалось, люминесценция биообъектов характеризуется очень слабой интенсивностью испускания. Для измерения эмиссионного спектра требуется аппаратура с чувствительностью на уровне квантового предела. Казалось бы, несколько лучше обстоит дело со спектром поглощения — для просвечивания образца можно использовать достаточно мощный источник света, и на пределе чувствительности работать не обязательно. Однако, как только интенсивность падающего света возрастает, начинает проявляться нелинейность биосреды, поскольку коэффициент поглощения существенно зависит от интенсивности. В результате измеряется вовсе не тот спектр, который требуется.

Экспериментаторы давно сумели преодолеть эту трудность с помощью определения спектра возбуждения. Нелинейность спектра поглощения обходится при этом с помощью того обстоятельства, что измеряется интегральная интенсивность, которая достаточно велика и, что особенно важно, не требует установления характера спектральной зависимости испускания. В то же время длину волны зондирующего излучения можно задавать с высокой точностью. Спектр возбуждения получается тем самым идентичным спектру поглощения, но без нелинейных особенностей.

4) квантовый выход флуоресценции h_фл — отношение числа излучаемых за секунду квантов N _флк числу поглощённых за секунду квантов N _п:

h_фл = N _фл / N _п.

Согласно закону Вавилова, квантовый выход люминесценции постоянен и не зависит от того, светом какой длины волны облучается молекула. Квантовый выход флуоресценции меняется при наличии тушителей флуоресценции, олигомеризации и т.д.

5) время жизни (затухания) t флуоресценции — время, в течение которого интенсивность флуоресценции уменьшается до уровня 1 /е начальной величины; связь между интенсивностью флуоресценции I _фл и временем жизни t определяется выражением:

I _фл = I _фл0 е^{- t / t},

где I _фл0 — максимальная интенсивность флуоресценции во время возбуждения; t флуоресценции зависит от типа растворителя (окружающих молекул), от связи с другими молекулами, олигомеризации, изменения конформации молекул, рН окружающей среды и т.д.

Основываясь на принципах расчета молекулярных спектров по Борну-Оппенгеймеру, можно вычислить собственное излучательное время жизни возбужденного состояния, которое для флуоресценции имеет вид:

,                                        (2.8)

где ν_max—средняя частота полосы поглощения; m(ν) — частотная зависимость коэффициента экстинкции. Величина  представляет собой время жизни возбужденного состояния в отсутствие других путей дезактивации (см. рис.2.5). Если полоса поглощения симметрична, то (2.8) можно упростить:

                                                             (2.9)

Здесь m_max— коэффициент экстинкции в максимуме полосы поглощения; — ширина полосы на половине высоты. Таким образом, можно рассчитать излучательное время жизни возбужденного состояния из спектроскопических данных.

Флуоресценция является относительно быстрым процессом, поскольку излучательный переход разрешен (обычно  лежит в пределах от 10^-9 до 10^-6 с). Это, конечно, очень много по сравнению с единичным актом первичного поглощения (~10^-15 с), но в то же время это достаточно мало по сравнению с временами распада возбужденного состояния для биолюминесценции и фосфоресценции.

Отметим также, что вычисляемое таким образом время для флуоресценции больше, чем экспериментально определяемое, поскольку фактическое время  представляет собой величину, обратную сумме всех констант скоростей процессов распада возбужденного состояния.

Излучательное время жизни для фосфоресценции дается выражением

                                         (2.10)

где g ₃и g ₁ — факторы вырождения триплетного и синглетного состояний соответственно.

Такие запрещенные переходы имеют малые коэффициенты экстинкции, и поэтому время жизни, вычисленное из (2.10), оказывается большим (от 10^-3 с до нескольких минут и даже часов). Это эквивалентно утверждению, что состояние, которое трудно заселить путем непосредственного возбуждения, так же трудно распадается путем излучательного процесса. По этой причине триплетные состояния играют преобладающую роль в фотохимии биомолекул, поскольку при прочих равных условиях они живут гораздо дольше синглетных и имеют более высокую вероятность вступить в фотохимическую реакцию. Этот факт усугубляется еще и тем обстоятельством, что в триплетном состоянии внешние электроны не спарены;

6) степень поляризации Р и степень анизотропии r флуоресценции определяется распределением электромагнитных колебаний относительно направления наблюдения.

При возбуждении поляризованным светом испускание флуоресцирующего образца тоже поляризовано. Поляризация является результатом фотоотбора молекул флуорофора в соответствии с их ориентацией по отношению к направлению вектора поляризации возбуждающего излучения. Испускание может быть поляризовано по ряду причин, в том числе из-за вращательной диффузии флуорофора. Деполяризация флуоресценции выражается через степень поляризации P = (I _// - I _^)/(I _// + I _^) (см. Л1) или анизотропию флуоресценции r = (I _// - I _^)/(I _// + 2 I _^), где I _//, I _^ — интенсивности флуоресценции, поляризованной параллельно и перпендикулярно вектору поляризации возбуждающего излучения. За время жизни t возбуждённого состояния молекула успевает повернуться, и происходит деполяризация излучения по сравнению с поглощённым квантом. Деполяризация тем больше, чем быстрее поворачивается молекула, т.е. чем меньше вязкость её окружения. Поэтому поляризацию флуоресценции определяют, чтобы, например, изучить микровязкость структуры клетки. Согласно формуле Перрена-Яблонского

1/ Р – 1/3 = (1/ Р ₀ – 1/3)(1 + RT t / V h);                                      (2.11)

где Р ₀ — максимальная степень поляризации; t — время жизни флуоресценции; V — объём моля флуоресцирующих молекул; h — вязкость среды.

Поляризация флуоресценции несёт информацию о молекулярной организации биообъектов и патологических изменениях в тканях, клетках и субклеточных структурах.

Франсис Перрен (1901-1992) Французский физик, член Парижской АН (1953). Профессор Парижского университета (1935-1941, 1945), Колумбийского университета (1941-1944), Коллеж де Франс (1946-1972). Глава Комиссариата по атомной энергии (1951-1970). Работы по молекулярной физике, оптике, атомной и ядерной физике. Автор оригинального представления таблицы Менделеева.

Анизотропное световое возбуждение позволяет выделить из хаотической группы атомов или молекул определённую группу. Измерение анизотропии флуоресценции, в том числе с временным разрешением, позволяет получать ин-формацию о размерах молекул флуорофора (при известном микроокружении) или о микроокружении, если известны параметры флуорофора.

Многие важные биологические объекты характеризуются собственной флуоресценцией или имеют флуоресцирующие компоненты-флуорофоры. Собс-твенную флуоресценцию не следует путать с биолюминесценцией. Повторим-ся: биолюминесценция есть процесс преобразования энергии химических реакций, в которых участвуют биомолекулы, в энергию электромагнитного излучения. Поглощение при биолюминесценции отсутствует. Собственная люминесценция есть процесс высвечивания биотканями предварительно поглощенной энергии электромагнитного излучения в виде электромагнитного же излучения, но в соответствии с законами, изложенными ниже.

Например, около 90 % флуоресценции белков обусловлено наличием в них ароматической аминокислоты триптофана, остальная часть приходится на тирозин, фенилаланин, цестеин и цистин. Квантовый выход УФ флуоресценции живой клетки составляет 1…4 %. При этом длины волн l_п =275...280 нм, l_фл = 300…350 нм и время жизни t = 1...7 нс не зависят от типа белка и его третичной структуры. Спектры поглощения и испускания триптофана, тирозина и фенилаланина изображены на рис. 2.8.

Рис. 2.8. Спектры поглощения (а) и люминесценции (б) триптофана (1), тирозина (2) и фенилаланина (3). ελ — молярный коэффициент поглощения; I л — интенсивность люминесценции.

Спектр поглощения триптофана определяется его индольным кольцом. Этой аминокислоте присущи две полосы поглощения — с максимумами в области 218 нм и 280 нм. Вторая, более длинноволновая, полоса поглощения является преобладающей. Даже малое содержание триптофана в белке существенно влияет на характер его спектров, так как молярный коэффициент поглощения этой аминокислоты в 4 раза больше, чем тирозина, и почти в 30 раз больше, чем фенилаланина. При возбуждении раствора триптофана ультрафиолетом с λ≤300 нм возникает его флуоресценция, максимум которой приходится на λ≈350 нм. Квантовый выход флуоресценции триптофана в нейтральном водном растворе при комнатной температуре достигает 0,2.

Спектр поглощения тирозина обусловлен его фенольным кольцом. Максимумы в спектре поглощения приходятся на 222 и 275 нм. В нейтральном водном растворе при комнатной температуре максимум флуоресценции тирозина приходится на λ = 303...304 нм, квантовый выход равен 0,21.

Спектры поглощения и флуоресценции фенилаланина связаны с наличием бензольного кольца. Максимум в спектре поглощения приходится на λ = 257 нм, квантовый выход невелик — от 0,038 до 0,045.

Если белок содержит все три аминокислоты, то в суммарном спектре флуоресценции преобладает триптофановая люминесценция. При отсутствии триптофана спектры флуоресценции белковой молекулы и тирозина практически совпадают. Свечение фенилаланина проявляется только при отсутствии других ароматических аминокислот.

Таким образом, анализ спектров флуоресценции белка дает возможность прецизионного распознавания его состава. В клетках человека содержится много белков, в состав которых входят перечисленные аминокислоты. Это актин, миозин, тропонин, ферменты типа дегидрогеназ, фосфатаз, оксидаз, некоторые гормоны, пищеварительные ферменты (пепсин, трипсин, химотрипсин), альбумины и глобулины плазмы крови и ряд других веществ. Собственная ультрафиолетовая флуоресценция этих белков определяется главным образом триптофаном, причем их спектры излучения сдвинуты в сторону коротких волн на 10…25 нм относительно спектров люминесценции водного раствора триптофана. Спектры белков, содержащих тирозин и фенилаланин в отсутствие триптофана и люминесцирующих практически так же, как и тирозин, свойственны РНКазе[1], гистонам, коллагену, тропомиозину, инсулину и ряду других веществ. Их максимум практически совпадает с максимумом флуоресценции водного раствора тирозина (λ=304 нм). Квантовый выход здесь мал (не выше 0,1, а чаще 0,04…0,05).

Флуоресцируют также восстановленные пиридин-нуклеотиды НАД•Н и НАДФ•Н[2] (l = 440…480 нм) и окисленные флавопротеины (ФП) (l = 510…540 нм), которые участвуют во внутриклеточных процессах: гликолиз, цикл Кребса, дыхание. Поэтому при флуоресцентном анализе могут быть выявлены любые сдвиги в клеточном метаболизме, отражающиеся на динамике свойств НАД•Н и ФП.

Собственной флуоресценцией в УФ диапазоне обладают сократительный аппарат клетки, митохондрии и некоторые другие клеточные структуры, причём её интенсивность зависит от физиологического состояния клеток и меняется при различных воздействиях на клетки. Порфирины флуоресцируют в красной области спектра (630…670 нм).

Спектры собственной ультрафиолетовой флуоресценции различных клеток имеют качественное сходство. Различие в основном просматривается в интенсивности свечения. Наиболее интенсивно светятся клетки мышц, на 25…30% слабее – нейроны и примерно вдвое слабее — гепатоциты. Измерение относительных величин свечения различных клеток в области 300…350 нм позволяет получать диагностическую информацию о состоянии соответствующих тканей.

Поскольку флуоресценция в некоторых случаях очень слаба, для получения информации используют сторонние флуорофоры в качестве меток (образуют химическую связь), или зондов (образуют нековалентную связь с мембраной). Флуоресцентные зонды, например, позволяют определить поверхностный заряд или трансмембранный потенциал клеточных мембран, изменение конформации белков и т.д. Использование флуоресцентных зондов позволяет производить диагностику многих заболеваний, например, аллергию, токсикозы, атеросклероз, раковые опухоли и др.