Анализ обширного материала, относящегося к развитию повреждений в разных клетках под влиянием различных неблагоприятных факторов, показал, что общими для всех поврежденных клеток наряду с описанными выше морфологическими изменениями являются увеличение внутриклеточного содержания кальция и нарушение биоэнергетических функций митохондрий. Эти два события не просто следствие других изменений в поврежденных клетках, они лежат в основе нарушения функций поврежденных клеток и могут рассматриваться как главные звенья в цепи событий, приводящих к развитию неспецифической реакции клеток на повреждение, поэтому заслуживают особого рассмотрения.
Накопление ионов кальция в гиалоплазме. В нормальных клетках концентрация ионов кальция в клеточном соке отличается исключительно низкими значениями: 10-7 или даже 10-8 моль/л, тогда как в окружающей клетку среде содержится 10-3 моль/л ионов кальция. При этом следует иметь в виду, что ионы Са2+ проходят в клетку не только самопроизвольно (процесс "утечки" через мембрану), но и через кальциевые каналы в мембране, которые открываются в ответ на изменение мембранного потенциала (потенциалзависимые кальциевые каналы, например, в нервных клетках) или в ответ на присоединение гормонов и медиаторов к мембранным рецепторам (например, адреналина к адренорецепторам в клетках сердечной мышцы). Компенсирует вход ионов Са2+ в клетку работа трех типов кальциевых насосов: кальциевая помпа (Са2+-АТФ-аза) в мембранах саркоплазматического ретикулума и клеточной мембране, система аккумуляции Са2+ в митохондриях, в некоторых клетках Na+-Са2+-обменник, встроенный в цитоплазматическую мембрану (см. рис. 1,4).
При повреждении клетки нарушается работа митохондрий: снижается мембранный потенциал и прекращается окислительное фосфорилирование. При снижении мембранного потенциала в митохондриях уменьшается накопление Са2+. Снижение уровня АТФ в клетке приводит к выключению работы Са2+ - АТФ-азы саркоплазматической. Все это способствует накоплению кальция в цитоплазме ретикулума и клеточной мембране. Увеличение концентрации Na+ в клетке вследствие угнетения Na+-насоса при недостатке АТФ приводит к выключению также и системы Na+-Са2+ обмена через клеточную мембрану.
Нарушение биоэнергетических функций митохондрий. Выше уже не раз упоминалось о том, что нарушение биоэнергетических функций митохондрий - одно из наиболее ранних проявлений повреждения клеток. Например, после прекращения кровообращения происходит нарушение окислительного фосфорилирования в митохондриях через 20-30 мин в печени и через 30-60 мин - в почках. Приблизительно в эти же сроки появляются и другие признаки повреждения клеток.
Существует несколько биохимических показателей нарушения функций митохондрий. Один из наиболее важных - коэффициент Р/O, который рассчитывается как отношение:
В последнее время чаще используют так называемый коэффициент дыхательного контроля (ДК); который находят из результатов определения скорости потребления кислорода (V3) суспензией изолированных митохондрий в условиях фосфорилирования, т. е. в присутствии кислорода, субстратов дыхания, АДФ и ортофосфата (рис. 2, наклон кривой на участке 3) и в условиях дыхательного контроля, т. е. в присутствии кислорода и субстратов, но в отсутствие АДФ (V4) (рис. 2, наклон кривой на участке 4): ДК = V3/V4.
Измерения величины V3 и V4 осуществляют полярографическим методом, определяя концентрацию кислорода в суспензии митохондрий с помощью платинового электрода (катода); суспензия при этом находится в закрытой кювете и перемешивается с определенной интенсивностью. При повреждении митохондрий происходит уменьшение V3 и увеличение V4, в результате чего ДК снижается от обычных значений 3-4 до теоретического предела 1. Снижение дыхания в фосфорилирующем состоянии (V3) обычно свидетельствует о нарушении работы дыхательной цепи митохондрий, связанном с потерей цитохрома С либо с нарушением работы оксидоредуктаз. Возрастание V4 - верный признак увеличения проницаемости мембран митохондрий для ионов, в частности для ионов водорода. Снижение ДК до единицы сопровождается снижением коэффициента Р/O до нуля и является свидетельством разобщения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях.
Параллельно разобщению окислительного фосфорилирования наблюдается потеря способности митохондрий к накоплению ионов кальция. Нормально функционирующие митохондрий обладают высокой кальцийаккумулирующей способностью. В присутствии избытка субстратов дыхания и при наличии кислорода и ортофосфата митохондрий печени способны накопить в матриксе количество фосфорнокислого кальция, по массе превышающее массу митохондрий в сотни и даже в тысячу раз! Повреждение митохондрий приводит к падению разности потенциалов на митохондриальной мембране. Положительно заряженные ионы кальция, удерживаемые в матриксе электрическим полем, начинают выходить наружу из поврежденных митохондрий.
Разобщение окислительного фосфорилирования и снижение кальций-аккумулирующей способности при повреждении митохондрий имеют самые драматические последствия для клетки. Снижение уровня АТФ в клетке в результате разобщения окисления и фосфорилирования приводит к выключению ионных насосов, входу в клетку Са2+, Na+ и воды, выходу K+, нарушению всех биохимических процессов, требующих затраты энергии АТФ. Снижение кальцийаккумулирующей способности митохондрий и выход ионов Са2+ из матрикса митохондрий в цитоплазму приводят к активации целого комплекса ферментных систем, активируемых ионами кальция, включая фосфолипазы, многие системы биосинтезов и протеинкиназы; метаболизм клетки вначале активируется, а затем дезорганизуется.
Согласно современным представлениям именно повреждение митохондрий является ключевым моментом, после которого изменения в клетке, вызванные повреждающим агентом, становятся необратимыми и клетка погибает.
Последовательность нарушений в клетке при гипоксии. Последовательность изменений в клетке в результате прекращения доступа кислорода (аноксии) одинакова для самых различных тканей. Это показали опыты со срезами тканей, изолированными клетками и изолированными клеточными органеллами, в частности митохондриями. В печени, находящейся в условиях аноксии при комнатной температуре, последовательность событий такова:
0-5 мин аноксии: снижение уровня АТФ в клетке в 2-4 раза, несмотря на активацию гликолиза;
5-15 мин: появление Ca2+ в цитоплазме клетки. Активация гидролитических ферментов, в том числе фермента фосфолипазы А2 митохондрий;
15-30 мин: гидролиз митохондриальных фосфолипидов фосфолипазой и нарушение барьерных свойств митохондриальной мембраны. Реоксигенация ткани на этой стадии приводит к активному набуханию митохондрий. Дыхательный контроль в митохондриях нарушен, окислительное фосфорилирование разобщено, способность митохондрий накапливать ионы кальция снижена;
30-60 мин: частичное восстановление функций митохондрий, временное повышение дыхательного контроля, способности накапливать кальции. Механизм компенсаторных процессов, приводящих к временному улучшению функций митохондрий, неизвестен, но связан с функцией клетки в целом, так как в изолированных митохондриях этого явления регенерации не наблюдается;
60-90 мин: необратимое повреждение митохондрий и полная гибель клеток.
При температуре тела человека все эти процессы протекают примерно в два раза быстрее, чем указано выше. В клетках мозга скорость этих процессов примерно вдвое выше, а в клетках мышц - почти вдвое медленнее, чем в печени.
Таким образом, можно считать, что развитие повреждения клеток при гипоксии проходит через одни и те же стадии во всех клетках организма, хотя и с разной скоростью. Показано также, что любая неспецифическая реакция клеток на повреждение очень часто начинается с увеличения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме, активации гидролитических ферментов, в частности фосфолипаз, нарушения барьерной функции митохондрий, разобщения окислительного фосфорилирования. Специфическая стадия повреждения заканчивается увеличением концентрации внутриклеточного кальция. В одних случаях это связано с повреждением цитоплазматической мембраны или активацией кальциевых каналов, в других - с недостатком обеспечения клетки кислородом, в третьих - с первичным повреждением митохондрий, например ионами тяжелых металлов, в четвертых - с активацией перекисного окисления липидов, например при УФ-облучении ткани и т. д. По мере повышения концентрации ионов кальция в гиалоплазме начинается стадия неспецифической реакции клетки, которая может привести к ее необратимому повреждению и даже гибели.
Схема развития неспецифической реакции клеток на повреждение приведена на рис. 3.
