Ч А С Т Ь II
Ф У Н К Ц И И И О Б М Е Н
О С Н О В Н Ы Х В Е Щ Е С Т В В О Р Г А Н И З М Е
РАЗДЕЛ VII. ОБМЕН И ФУНКЦИЯ УГЛЕВОДОВ
Занятие № 19
ТЕМА. ПЕРЕВАРИВАНИЕ И ВСАСЫВАНИЕ УГЛЕВОДОВ. СИНТЕЗ И РАСПАД ГЛИКОГЕНА. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ И КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.
Цель занятия: 1.Повторить физико-химические свойства и биологическую роль углеводов.
2.Изучить процессы переваривания и всасывания углеводов.
3.Ознакомиться с обменом гликогена.
4.Овладеть методами качественного и количественного определения глюкозы в моче.
Исходный уровень знаний:
- строение моносахаридов;
- строение и свойства олигосахаридов;
- строение и свойства крахмала, гликогена, целлюлозы;
- классификация и биологическая роль углеводов;
- классификация и номенклатура ферментов.
Содержание занятия.
I.2. Стереоизомерия моносахаридов.
Циклические формы моносахаров.
Реакции полуацетального гидроксила.
Реакции с участием карбоксильной группы.
Физико-химические свойства и биологическое значение мальтозы, сахарозы и лактозы.
Особенности строения и биологическая роль гомо- и гетерополисахаридов.
Переваривание и всасывание углеводов.
Синтез гликогена.
Гликогенолиз.
II.1. Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА САХАР
В МОЧЕ.
Для определения сахара в моче применяются качественные реакции Троммера, Фелинга, Ниландера, основанные на окислении свободной альдегидной группы углеводов (напр., глюкозы до глюконовой кислоты) и восстановления металлов (медь, висмут, и др.) из их окисных соединений. Эта реакция довольно быстро происходит при нагревании в щелочной среде. Восстановленная форма металлов окрашена в характерный цвет (напр., закись меди - в красный, висмут - в черный).
Химизм реакции Троммера см. ч.I, зан. №4, работа №1.
Проба с жидкостью Фелинга основана на том же принципе, что и реакция Троммера. Отличие и преимущество этой реакции заключается в том, что Фелинг предложил прибавлять сегнетову соль для связывания избытка гидрата окиси меди, из которого при нагревании образуется оксид меди (СuO) - осадок черного цвета, затемняющий реакцию при малых количествах глюкозы в исследуемом образце.
COONa COONa
| |
(CHOH)2+ Cu(OH)2 → (CHO)2Cu + 2H2O
| |
COOK COOK
Порядок выполнения работы.
а) Реакция Троммера.
К 5 кап. мочи прибавить 5 кап. 10% раствора едкого натрия и 5 кап. 1% раствора сернокислой меди, нагреть.
РЕЗУЛЬТАТ:
б) Реакция с жидкостью Фелинга.
К 20 кап. мочи прилить 10-20 кап. жидкости Фелинга и нагреть до кипения верхний слой жидкости.
РЕЗУЛЬТАТ:
РАБОТА № 2. ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
САХАРА В МОЧЕ.
Порядок выполнения работы.
Насыпать в пробирку небольшое количество порошка (состав: 1 часть сернокислой меди + 10 частей безводного углекислого натрия), прибавить несколько капель мочи, подогреть.
РЕЗУЛЬТАТ:
Э Т А Л О Н
| Цвет раствора | Количество сахара |
| Синий | Отсутствует |
| Желто-зеленый | 0,5% (5 г/л) |
| Коричнево-красный | 1-2% (10-20 г/л) |
| Красный | свыше 2% (20 г/л) |
ВЫВОД:
Клинико-диагностическое значение.
В норме сахар с мочой выделяется в ничтожно малых количествах и обычными методами не определяется.
Появление сахара в моче в количествах, которые можно определить обычными клиническими методами, носит название глюкозурии. Моча содержит, в основном, глюкозу и, реже, фруктозу и галактозу. Глюкозурия может быть функциональная (пищевая, эмоциональная) и патологическая (при заболевании почек, при сахарном диабете), когда в суточной моче может содержаться до 200-300 г глюкозы. Иногда глюкозурия наблюдается при беременности.
III.2.Контрольные вопросы.
Что является мономером крахмала и целлюлозы?
Какие виды амилаз вы знаете, где функционируют a и b-амилазы и как гидролизуют крахмал (гликоген)?
Что такое глюкозурия?
Когда отмечается физиологическая глюкозурия?
Какие заболевания сопровождаются глюкозурией?
Материал для самоподготовки. а)1 с. 319-327, 665-669; II, III.
Занятие № 2О
ТЕМА. ГЛИКОЛИЗ, ГЛИКОГЕНОЛИЗ, ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ ПИРУВАТА. ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОДУКТОВ ГЛИКОЛИЗА В БИОЛОГИ-ЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.
Цель занятия: 1.Изучить анаэробный и основной аэробный путь окисления глюкозы.
2.Ознакомиться с методами качественного опре-деления продуктов гликолиза и витамина В1.
Исходный уровень знаний:
- строение и физико-химические свойства основных углеводов;
- всасывание углеводов в желудочно-кишечном тракте;
- обмен гликогена;
- цикл трикарбоновых кислот;
- классификация и номенклатура ферментов;
- витамины В1, В2, В3, РР, липоевая кислота.
Содержание занятия.
I.2. Гликолиз: локализация в клетке, химизм, ферменты, коферменты, физиологическое значение, энергетическая ценность.
Сходство и различие гликолиза и гликогенолиза, а также гликолиза и спиртового брожения.
Глюконеогенез: химизм, ферменты, биологическая роль.
Дихотомический путь окисления глюкозы: этапы, локализация в клетке, химизм, ферменты, коферменты, энергетическая ценность.
II.1. Работа № 1. ИЗУЧЕНИЕ ВЕЩЕСТВ, ОБРАЗУЮЩИХ-
СЯ В ПРОЦЕССЕ ГЛИКОЛИЗА.
а) Открытие триозофосфатов.
Принцип метода.
В процессе гликолиза образуются различные промежуточные фосфорилированные продукты (фосфорные эфиры гексоз, триоз и т.п.). Принцип метода определения фосфора заключается в образовании комплексной фосфорномолибденовой кислоты, которую затем восстанавливают гидрохиноном в молибденовую синь.
Порядок выполнения работы.
| Реактивы (мл) | Опыт | Контроль |
| Безбелковый фильтрат | 0,5 | 0,5 |
| 2N pаствоp NaОН | 0,5 | - |
| Дистиллированная вода | - | 0,5 |
| Смешать и оставить при комнатной температуре на 15 мин. | ||
| Молибденовый реактив | 0,5 | 0,5 |
| 2N pаствоp HCl | 0,5 | 0,5 |
| 1% раствор гидрохинона | 0,5 | 0,5 |
| Смешать и оставить при комнатной температуре на 5 мин. | ||
| 20% NaHSO3 | 0,2 | 0,2 |
РЕЗУЛЬТАТ:
б) Открытие фруктозодифосфата при помощи реакции Селиванова.
Принцип метода и химизм реакции.
Из фруктозы при нагревании с крепкой соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол, который дает с резорцином продукт конденсации вишнево-красного цвета.
HOCH2 О CH2OH -3H2O O
| H HO | HOH2C- -C=O
H | | OH H
OH H
Порядок выполнения работы.
В пробирку внести 0,5 мл реактива Селиванова, хорошо перемешать с 0,5 мл безбелкового фильтрата, слегка подогреть на плитке. Окраска зависит от концентрации фруктозодифосфата.
РЕЗУЛЬТАТ:
в) Открытие молочной кислоты.
Принцип метода и химизм реакции.
Молочная кислота в присутствии фенолята железа (реактив Уффельмана), окрашенного в фиолетовый цвет, образует лактат железа желто-зеленого цвета.
 |
3 -OH + FeCl3 (C6H5O)3Fe + 3HCl
фенолят железа
 |  |
COOH COO Fe
| |
(C6H5O)3Fe + 3HCOH HCOH + 3 C6H5OH
| |
CH3 CH3 3
лактат железа
Порядок выполнения работы.
В пробирку налить 1 мл приготовленного ex tempore реактива Уффельмана (смесь 20 кап. 1% раствора фенола и 2 кап 1% раствора хлорного железа), прибавить 0,5 мл безбелкового фильтрата мышц.
РЕЗУЛЬТАТ:
Работа № 2. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ВИТАМИН В1.
Витамин В1 еще называется тиамин, т.к. в своей структуре содержит серу и азот. Тиаминпирофосфат участвует в окислительном декарбоксилировании a-кетокислот и в транскетолазной реакции, входя в состав ферментов.
Недостаток витамина В1 в пище вызывает поражение периферической нервной системы, известное под названием "бери-бери". При этом накапливаются пировиноградная кислота и другие a-кетокислоты.
Принцип метода.
В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета (диазореакция).
Порядок выполнения работы.
К диазореактиву, состоящему из 5 кап. 1% раствора сульфаниловой кислоты и 5 кап. 5% раствора нитрата натрия, добавить 1-2 кап. 5% раствора тиамина, затем по стенке пробирки осторожно наслоить 5-7 кап. 10% раствора бикарбоната натрия. На границе раздела жидкостей отметить появление цветного кольца.
РЕЗУЛЬТАТ:
III.2. Контрольные вопросы.
Какие реакции гликолиза являются эндэргоническими?
Какие реакции гликолиза являются экзэргоническими?
Каков энергетический эффект гликолиза (исчисляемый в молекулах АТФ)?
Каков КПД гликолиза?
Какие триозофосфаты образуются в процессе гликолиза?
Указать качественную реакцию на триозофосфаты.
Указать качественную реакцию на фруктозу.
На чем основано качественное определение тиамина?
Каков принцип метода определения молочной кислоты?
Материал для самоподготовки. а) 1. с.327-345; II, III
Занятие № 21
ТЕМА. ПУТИ АЭРОБНОГО ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ. РЕГУЛЯЦИЯ И НАРУШЕНИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ.
Цель занятия: 1.Изучить аэробные пути окисления глюкозы.
2. Ознакомиться с регуляцией и патологией углеводного обмена.
3.Овладеть методом количественного определения глюкозы крови.
Исходный уровень знаний:
- химия моносахаридов;
- анаэробное окисление глюкозы в организме;
- регуляция активности ферментов;
- пиридинзависимые оксидоредуктазы.
Содержание занятия.
I.2. Цикл трикарбоновых кислот.
Пентозофосфатный путь окисления глюкозы: локализация в клетке, химизм окислительной ветви, ферменты, энергетическая ценность, биологическое значение.
Взаимосвязь дихотомического и апотомического путей окисления глюкозы.
Регуляция углеводного обмена: роль ЦНС, желез внутренней секреции, ц-АМФ.
Патология углеводного обмена: причины, симптоматика, примеры энзимопатий.
"Сахарные" кривые, диагностическое значение.
II.1. Лабораторная работа. ОРТОТОЛУИДИНОВЫЙ МЕТОД
КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ.
Принцип метода и химизм реакции.
Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты образует комплекс сине-зеленого цвета, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре.
 | |||
 | |||
-NH2 + O=C-H H2O + -N=C-H
| │ │ │
CH3 R CH3 R
Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови.
Инсулин вырабатывается поджелудочной железой и вызывает снижение уровня глюкозы в крови. Препарат инсулина применяется при лечении сахарного диабета. Особенно чувствительна к снижению уровня сахара в крови ЦНС, т.к. глюкоза является для нее основным источником энергии. Снижение сахара в крови ниже 2,77 ммоль/л (50 мг%) вызывает судороги и может привести к смерти.
Под влиянием инсулина стимулируется синтез гликогена в печени и мышцах, тормозится распад гликогена, глюкоза превращается в липиды, увеличивается проницаемость глюкозы через клеточные мембраны в мышечной и жировой ткани, стимулируется активность гексокиназы (фермент гликолиза), активируется цикл Кребса.
Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови.
Адреналин вырабатывается мозговым веществом надпочечников, в высоких концентрациях является сильным ядом. При введении адреналина содержание глюкозы в крови увеличивается, развивается гипергликемия и, если уровень ее достигает 8,88 ммоль/л (160 мг%), появляется глюкозурия. Увеличение содержания глюкозы в крови под действием адреналина объясняется, в первую очередь, усилением в печени распада гликогена до глюкозы.
Порядок выполнения работы.
Определив содержание глюкозы в нескольких пробах крови ортотолуидиновым методом, надо сделать вывод о том, в каком случае кровь получена от интактного животного, после введения кролику инсулина либо адреналина.
| Реактивы (мл) | Центрифужные пробирки | ||||
| Контроль | 1 | 2 | 3 | ||
| 3% раствор ТХУ | 0,9 | 0,9 | 0,9 | 0,9 | |
| стандартный раствор глюкозы | 0,1 | - | - | - | |
| сыворотка № 1 | - | 0,1 | - | - | |
| сыворотка № 2 | - | - | 0,1 | - | |
| сыворотка № 3 | - | - | - | 0,1 | |
| Центрифугировать 10 мин. при 3000 об./мин. | |||||
| Сухие пробирки | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| Ортотолуидиновый реактив | 4,5 | 4,5 | 4,5 | 4,5 | |
| Надосадочная жидкость из соответствующей пробирки | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
0,5 | |
| Поместить точно на 8 мин. в кипящую водяную баню. Затем охладить до комнатной температуры. | |||||
|
|
Измерить оптическую плотность против воды в кювете на 10 мм с красным светофильтром (620 нм).
РАСЧЕТ:
, где
Соп - концентрация глюкозы в крови в пробе;
Сст - концентрация глюкозы в стандартной пробе;
Еоп - оптическая плотность пробы;
Ест - оптическая плотность стандарта глюкозы.
Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,0555.
Нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови человека, определяемое данным методом, колеблется в пределах 3,33-5,55 ммоль/л (60-100 мг%).
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы.
Какие гормоны и почему могут стимулировать гипер-гликемию?
Какие гормоны и почему вызывают гипогликемию?
При какой концентрации глюкозы в крови появляется глюкозурия?
Каков характер "сахарной" кривой у здорового человека и больного сахарным диабетом?
Материал для самоподготовки. а)1. с.345-362, 267-272; II, III
Занятие № 22
КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ
"ОБМЕН И ФУНКЦИИ УГЛЕВОДОВ"
Вопросы к коллоквиуму.
1. Основные углеводы пищи. Общая характеристика и классификация углеводов. Биологическая роль в организме.
2. Переваривание и всасывание углеводов в желудочно-ки-шечном тракте (особенности углеводного обмена у детей).
3. Глюкоза - важнейший метаболит углеводного обмена. Общая схема источников и путей расходования глюкозы в организме.
4. Структура, свойства, распространение гликогена в тканях как резервного полисахарида. Физиологическое значение мобилизации гликогена, механизм.
5. Биосинтез гликогена и его физиологическое значение. Гликогенозы и агликогенозы.
6. Роль гормонов (адреналина, глюкагона, инсулина), ц-АМФ и протеинкиназ в биосинтезе и мобилизации гликогена.
7. Представления о строении и функциях гликозаминогликанов. Роль гиалуроновой и хондроитинсерной кислот в нормальном функционировании межклеточного вещества и развитии патологических состояний. Значение гепарина в медицинской практике.
8. Последовательность реакций анаэробного распада глюкозы (гликолиз) и гликогена (гликогенолиз). Дальнейшая судьба молочной кислоты.
9. Физиологическое значение гликолиза и его энергетическая ценность. Роль анаэробного распада глюкозы в мышцах.
10. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты.
11. Участие витаминов в процессе образования активного ацетата.
12. Этапы основного аэробного (дихотомического) пути окисления глюкозы, его распространение в организме человека и физиологическое значение.
13. Цикл трикарбоновых кислот: последовательность реакций и характеристика ферментов.
14. Физиологическая роль цикла трикарбоновых кислот. Аллостерический механизм регуляции цикла лимонной кислоты.
15. Энергетический баланс дихотомического пути окисления глюкозы в тканях.
16. Пентозофосфатный (апотомический) путь превращения глюкозы, физиологическое значение. Химизм окислительной ветви и энергетический баланс.
17. Взаимосвязь дихотомического и апотомического путей окисления глюкозы. Соотношение анаэробного и аэробного путей распада глюкозы при мышечной работе и их роль в организме.
18. Глюконеогенез: химизм реакций, характеристика ферментов, биологическая роль.
19. Аллостерические механизмы регуляции гликолиза и глюконеогенеза (АТФ, АДФ, АМФ, НАД, НАДН+ как аллостерические эффекторы).
20. Взаимосвязь гликолиза и глюконеогенеза.
21. Нейрогуморальная регуляция углеводного обмена. Наследственные нарушения углеводного обмена.
22. Роль инсулина в поддержании постоянного уровня сахара в крови. Сахарные кривые, их диагностическое значение.
РАЗДЕЛ VIII. ОБМЕН И ФУНКЦИИ ЛИПИДОВ
Занятие № 23
ТЕМА. ПЕРЕВАРИВАНИЕ И ВСАСЫВАНИЕ ЛИПИДОВ. УЧАСТИЕ ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ В ПРОЦЕССЕ УСВОЕНИЯ ЛИПИДОВ.
Цель занятия: 1.Повторить физико-химические свойства и био-логическую роль липидов.
2.Знать процессы переваривания и всасывания липидов, роль желчных кислот.
3.Ознакомиться с методами качественного определения желчных кислот и активности липаз.
Исходный уровень знаний:
- строение и свойства высших жирных кислот;
- строение и свойства нейтральных жиров;
- строение и свойства сложных липидов;
- биологическая роль липидов;
- классификация и номенклатура ферментов.
Содержание занятия.
I.2.Строение и свойства природных высших жирных кислот на примере пальмитиновой, олеиновой, линолевой и других кислот.
Классификация липидов.
Физико-химические свойства и биологическое значение триацилглицеринов.
Особенности строения и биологическая роль фосфолипидов.
Особенности строения и биологическая роль сфинголипидов.
Особенности строения и биологическая роль стероидов.
Переваривание и всасывание липидов.
Физиологическое значение желчных кислот.
II.1. Работа № 1. ВЛИЯНИЕ ЖЕЛЧИ НА АКТИВНОСТЬ
ЛИПАЗЫ.
Липаза - малоспецифичный фермент, действующий на многие жиры при рН=9,0, гидролитически расщепляющий эфирную связь в a-положении (т.е. в крайнем положении).
Принцип метода.
Скорость действия липазы в отдельных порциях молока можно узнать по количеству жирных кислот, образующихся при гидролизе жира за определенный промежуток времени. Количество жирных кислот (ЖК) определяют титрованием щелочью в присутствии фенолфталеина. В случае добавления в пробу желчи липаза активируется и гидролиз жиров молока протекает с большей скоростью. Результаты определения выражают в миллилитрах титрованного раствора щелочи. Строят графики, где по оси ординат откладывают количество 0,05 N раствора щелочи в миллилитрах, пошедшей на нейтрализацию жирных кислот, а на оси абсцисс - время в минутах.
Порядок выполнения работы.
| Реактивы (мл) | Колба № 1 | Колба № 2 |
| Молоко | 10,0 | 10,0 |
| 5% р-р панкреатина | 1,0 | 1,0 |
| Дистиллированная вода | 1,0 | - |
| Желчь | - | 1,0 |
| Быстро перемешать и поместить в термостат при t=380С | ||
Каждые 15 мин из обеих колб переносить в стаканчики по 1,0 мл смеси и сразу титровать 0,05 N раствором NaОН до слаборозового окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек. Всего провести 4 определения. По полученным данным построить 2 графика в одной системе координат.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
мл
0,05 N р-р NaOH
0 15 30 45 время в мин
ВЫВОД:
Работа № 2. ДЕЙСТВИЕ ФОСФОЛИПАЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ.
В поджелудочной железе и ее соке содержится несколько фосфолипаз - ферментов, ускоряющих гидролиз фосфолипидов, в частности, лецитина. Лецитин под действием фосфолипаз А1, А2, С и D расщепляется на глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и холин. Точки приложения действия фосфолипаз на лецитин (фосфатидилхолин):
фосфолипаза А1
фосфолипаза А2 СH2-O-CO-R
|
R-CO-О-CH
|
CH2-O-PO-O-CH2-СH2-N(CH3)3
|
OH
фосфолипаза С фосфолипаза Д
Принцип метода.
Об активности фосфолипаз поджелудочной железы судят по появлению свободной фосфорной кислоты, способной образовывать желтый осадок при нагревании с молибдатом аммония.
Порядок выполнения работы.
В две пробирки налить по 5 кап. суспензии яичного желтка. В первую пробирку добавить 2 кап. панкреатина, а во вторую (контроль) - 2 кап. воды. Обе пробирки поместить в термостат при t=380 C на 30 мин. После инкубации в обе пробирки налить по 5 кап. молибденового реактива, нагреть их на пламени горелки и охладить водой под краном.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОД:
Работа № 3. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ЖЕЛЧНЫЕ
КИСЛОТЫ.
Переваривание и всасывание липидов и жирорастворимых витаминов нарушается при воспалении печени, желчного пузыря и при желчнокаменной болезни.
Принцип метода.
Желчные кислоты можно открыть реакцией Петтенкофера. При взаимодействии желчной кислоты с оксиметилфурфуролом, образующимся из тростникового сахара под действием концентрированной серной кислоты, появляется красно-фиолетовое окрашивание.
Порядок выполнения работы.
На сухую чашку Петри, под которую подложен лист белой бумаги для лучшей визуализации результатов, нанести 2 кап желчи, 2 кап 20% раствора сахарозы и тщательно перемешать стеклянной палочкой, затем прилить 7 кап концентрированной H2SO4 и вновь перемешать. Через 2-3 мин отметить появление окраски.
РЕЗУЛЬТАТ:
III.2. Контрольные вопросы.
Какие условия нужны для переваривания липидов?
В каком отделе желудочно-кишечного тракта и под действием каких ферментов происходит основной распад липидов и почему?
Какие Вы знаете промежуточные и конечные продукты переваривания триглицеридов, фосфолипидов?
Как и в каком отделе желудочно-кишечного тракта происходит всасывание продуктов переваривания липидов?
Какие фосфолипиды Вы знаете?
Что такое лизофосфатидилхолины?
Что такое парные желчные кислоты?
Материал для самоподготовки.а)1. с.363-370; II, III
Занятие № 24
ТЕМА. ОКИСЛЕНИЕ И СИНТЕЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ. МЕТА-БОЛИЗМ КЕТОНОВЫХ ТЕЛ. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕ-ЛЕНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ В КРОВИ.
Цель занятия: 1.Усвоить химизм и значение b-окисления высших жирных кислот в тканях.
2.Уяснить процесс синтеза ВЖК в тканях.
3.Знать метаболизм кетоновых тел.
4.Овладеть методами качественного определения кетоновых тел и количественного определения триглицеридов в сыворотке крови.
Исходный уровень знаний:
- особенности строения ВЖК - компонентов липидов человека;
- структура нейтральных жиров;
- классификация и номенклатура ферментов;
- строение и биологическая роль витаминов РР, В2, В3, Н.
Содержание занятия.
I.2. Окисление ВЖК в тканях: локализация в клетке, химизм, энергетический выход (в молекулах АТФ).
Окисление глицерина в тканях.
Энергетический баланс окисления триацилглицеринов.
Синтез ВЖК: локализация в клетке, последовательность реакций, ферменты.
Участие витаминов в процессах окисления и синтеза ВЖК.
Современные представления о синтезе кетоновых тел (локализация в организме, химизм, значение).
II.1. Работа № 1. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА АЦЕТОН И АЦЕТОУКСУСНУЮ КИСЛОТУ.
К кетоновым телам относятся ацетон, b-оксимасляная и ацетоуксусная кислоты. В крови в норме они содержатся в очень небольшом количестве - 13,4-185,2 мкмоль/л (0,14-1,9 мг%). В моче обычными реакциями ацетоновые тела у здоровых людей не определяются.
а) Проба Легаля на ацетон.
Принцип метода и химизм реакции.
Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия продукт оранжево-красного цвета.
СН3-СО-СН3 + Na2[Fe(CN)5NO] + 2NaOH
aцетон нитропруссид натрия
Na4[Fe(CN)5NO=CH-CO-CH3] + 2H2O
комплексное соединение
После подкисления ледяной уксусной кислотой образуется соединение вишневого цвета.
Na4[Fe(CN)5NO=CH-CO-CH3] + CH3COOH
Na3[Fe(CN)5-NO-CH2-CO-CH3] + CH3COONa
Порядок выполнения работы.
В пробирку внести 1 кап мочи, 1 кап. 10% раствора NaOH и 1 кап. нитропруссида Na. Отметить окраску. Добавить 3 кап. ледяной уксусной кислоты.
РЕЗУЛЬТАТ:
б) Проба Герхарда на ацетоуксусную кислоту.
Принцип метода и химизм реакции.
Енольная форма ацетоуксусной кислоты вступает в реакцию с хлорным железом с образованием комплексного соединения вишнево-красного цвета. При стоянии окраска бледнеет вследствие спонтанного декарбоксилирования ацетоуксусной кислоты.
Порядок выполнения работы.
К 5 кап. мочи прибавить по каплям 5% раствор хлорного железа. Зафиксировать появление сначала осадка (FeРО4), а затем окрашивания.
N.B. При кипячении процесс протекает очень быстро. Сходное окрашивание возможно после приема салициловой кислоты, антипирина и др. лекарственных препаратов, но при этом окраска при стоянии и кипячении не исчезает.
РЕЗУЛЬТАТ:
Клинико-диагностическое значение.
Гиперкетонемия и кетонурия наблюдаются при сахарном диабете, приеме кетогенной пищи (дефицит углеводов), голодании, гиперпродукции гормонов (антагонистов инсулина), напр., кортикостероидов, болезни Гирке.
Гипокетонемия не имеет диагностического значения.
При сахарном диабете, когда печень бедна гликогеном, происходит усиленный распад жиров как источника энергии. В результате окисления ВЖК накапливается ацетил-КоА, что способствует его конденсации с накоплением кетоновых тел.
В раннем детском возрасте продолжительные желудочно-кишечные заболевания (дизентерия, токсикозы) могут вызвать кетонемию в результате голода и истощения.
Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИАЦИЛ-ГЛИЦЕРИДОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Принцип метода.
липаза
Триацилглицериды → глицерин + жирные кислоты
глицерокиназа
Глицерин + АТФ → глицерил-3-фосфат + АДФ
ГФО
Глицерил-3-фосфат + О2 → диоксиацетонфосфат + 2Н2О2
пероксидаза
Н2О2 + 4-ААР + 4-хлорфенол → хинонимин + 4 Н2О
Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе.
Порядок выполнения работы
| Реактивы (мл) | Р-р сравнения | Эталон | Проба |
| Рабочий реагент | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| Дистиллированная вода | 0,02 | - | - |
| Калибратор | - | 0,02 | - |
| Сыворотка крови | - | - | 0,02 |
| Содержимое пробирок перемешать, инкубировать не менее 15 мин. при t=26-250Сили 10 мин при t=370С | |||
Измерить оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кювете 1 см при длине волны 500 нм (490-520 нм). Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации при предохранении от прямого света.
РАСЧЕТ. По оптической плотности пробы (А) и калибратора (Б) рассчитать содержание триглицеридов (Х) пробы по формуле:
Х = А: Б • 200 мг/100мл
или Х = А: Б • 2,29 ммоль/л
В норме содержание триглицеридов в сыворотке крови составляет 0,15-1,71 ммоль/л или 13-160 мг/100 мл.
Группа риска - 1,71- 2,29 ммоль/л или 160-2060 мг/100 мл
Патологические показатели - >2,29 ммоль/л или 2000 мг/100 мл
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы.
Какие Вы знаете кетоновые тела?
Каково содержание кетоновых тел в крови в норме?
Где синтезируются кетоновые тела?
Как называется повышенное выделение кетоновых тел с мочой?
Каковы причины кетонурии?
Какова роль триацилглицеринов в организме?
Как подсчитывается энергетическая ценность окисления триацилглицеринов?
Сколько в норме в сыворотке крови триглицеридов?
Материал для самоподготовки. а)1 с.363-39; II, III
Занятие № 25
ТЕМА. БИОСИНТЕЗ ЛИПИДОВ И ХОЛЕСТЕРИНА. РЕГУЛЯ-ЦИЯ И НАРУШЕНИЯ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА.
Цель занятия: 1.Изучить обмен холестерина у человека.
2.Усвоить синтез триглицеридов и фосфоглицеридов.
3.Ознакомиться с регуляцией и патологией липидного обмена.
4.Овладеть методом количественного определения холестерина в сыворотке крови (по Ильку).
Исходный уровень знаний:
- строение и классификация липидов;
- регуляция активности ферментов;
- строение ц-АМФ, АТФ, ЦТФ;
- жирорастворимые витамины.
Содержание занятия.
I.2. Синтез и ресинтез триглицеридов.
Пути синтеза и ресинтез глицерофосфолипидов.
Синтез холестерина: локализация в организме, этапы, химизм I стадии.
Биологическое значение и структура стероидов - производных холестерина.
Выведение холестерина из организма.
Липопротеиды: виды, состав.
Регуляция липидного обмена: роль ЦНС, эндокринной системы, ц-АМФ.
Патология липидного обмена: причины, симптоматика, примеры энзимопатий.
II.1. Работа № 1. РЕАКЦИЯ ЛИБЕРМАННА-БУРХАРДТА
НА ХОЛЕСТЕРИН.
Холестерин и его эфиры содержатся в различных тканях и жидкостях животных: головном мозге, кожном сале, крови, желчи. В мозге холестерин в норме присутствует почти исключительно в свободном виде, а не в виде эфиров. В белом веществе мозга содержится 4-5% холестерина на влажную массу.
Принцип метода.
Раствор холестерина в хлороформе дает с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой красное окрашивание, переходящее затем в синее и зеленое. Под действием концентрированной серной кислоты происходит отщепление воды от вторичного спирта холестерина с последующей конденсацией непредельных углеводородов, соединяющихся с серной кислотой, и образованием окрашенных продуктов.
Порядок выполнения работы.
К 1 мл хлороформного экстракта из мозга добавить 10 кап уксусного ангидрида и 2 кап. концентрированной H2SO4 и хорошо перемешать. Отметить изменение окраски.
РЕЗУЛЬТАТ:
Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕ-РИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Принцип метода.
Холестерин взаимодействует с ацетангидридом и серной кислотой с образованием соединения зеленого цвета. Интерференция белков подавлена 2,5-диметилбензосульфоновой кислотой.
Порядок выполнения работы.
| Реактивы (мл) | Р-р сравнения | Эталон | Проба |
| Сыворотка крови | - | - | 0,1 |
| Стандартный –р (реактив 1) | - | 0,1 | - |
| Дистиллированная вода | 0,1 | - | - |
| Реактив 2 | 3,0 | 3,0 | 3,0 |
| Перемешать, на водяную баню t=20оС на 5 мин. | |||
| Реактив 3 (Н2SO4) | 0,6 | 0,6 | 0,6 |
| Быстро перемешать, на водяную баню t=20оС на 10 мин. | |||
Измерить оптическую плотность пробы и эталона против раствора сравнения в кювете 1 см при длине волны 560-590 нм.
РАСЧЕТ:
А1
Х = , где
А2
Х - количество холестерина в ммоль/л
А1 – оптическая плотность пробы
А2 – оптическая плотность стандарта.
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
Клинико-диагностическое значение.
При нарушении жирового обмена холестерин может накапливаться в крови. Увеличение содержания холестерина в крови (гиперхолестеринемия) наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, механической желтухе, нефрите, нефрозе (особенно при липоидных нефрозах), гипотиреозе.
Понижение холестерина в крови (гипохолестеринемия) наблюдается при анемиях, голодании, туберкулезе, гипертиреозе, раковой кахексии, паренхиматозной желтухе, поражении центральной нервной системы, лихорадочных состояниях, при введении инсулина.
III.2. Контрольные вопросы.
В каком виде холестерин содержится в сыворотке крови и тканях?
В чём заключается физиологическое значение холестерина?
Какова нормальная концентрация холестерина в сыворотке крови?
При какой патологии наблюдается гиперхолестеринемия?
Когданаблюдается гипохолестеринемия?
Назовите исходные вещества для синтеза холестерина.
Предшественником каких биологически активных соединений является холестерин?
Материал для самоподготовки. а)1 с.392-408, 556-558, 574-577,
245, 454; II, III
Занятие № 26
КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ:
quot;ОБМЕН И ФУНКЦИИ ЛИПИДОВ".
Вопросы к коллоквиуму.
1. Общая характеристика и классификация липидов. Биологическая роль в организме. Пищевые липиды, норма суточного потребления.
2. Переваривание и всасывание липидов в желудочно-кишечном тракте (особенности переваривания и всасывания жиров у детей раннего возраста).
3. Переваривание и всасывание сложных липидов (на примере глицерофосфолипидов) в желудочно-кишечном тракте.
4. Желчные кислоты и их роль в процессе пищеварения.
5. Ресинтез триацилглицеринов в кишечной стенке и синтез их в тканях. Физиологическое значение.
6. Ресинтез фосфоглицеролипидов в кишечной стенке и синтез их в тканях. Физиологическое значение.
7. Пути поступления липидов в ткани. Липопротеиды крови: особенности строения, состава и функции.
8. Роль хиломикронов в обмене жиров. Депонирование липидов в жировой ткани. Концентрация липидов в крови.
9. Значение метионина и холина для обмена липидов.
10. Внутриклеточный липолиз. Каскадный механизм активации липазы.
11. Транспорт и утилизация жирных кислот, образующихся при мобилизации жиров. Изменение скорости использования жирных кислот в зависимости от ритма питания и мышечной активности.
12. Бета-окисление высших жирных кислот (ВЖК). Последовательность реакций, связь с цитратным циклом и дыхательной цепью. Физиологическое значение.
13. Окисление глицерина в тканях. Энергетическая ценность этого процесса.
14. Энергетический баланс окисления триацилглицеринов в тканях.
15. Биосинтез ВЖК: последовательность реакций, место синтеза, физиологическое значение.
16. Участие витаминов в окислении и синтезе ВЖК. Роль пентозофосфатного пути обмена глюкозы для синтеза ВЖК. Зависимость скорости биосинтеза от ритма питания и состава пищи.
17. Кетоновые тела: место, химизм, регуляция синтеза. Утилизация кетоновых тел. Физиологическая концентрация кетоновых тел в крови, изменение этого показателя при сахарном диабете и голодании.
18. Представления о биосинтезе холестерина: химизм I стадии, регуляция процесса. Выведение холестерина из организма. Физиологическая концентрация холестерина в крови.
19. Холестерин как предшественник стероидных гормонов, желчных кислот, витамина Д.
20. Роль липопротеидов в обмене холестерина. Гиперхолестеринемия: ее причины и последствия. Современные биохимические основы атеросклероза.
21. Регуляция липидного обмена. Влияние адреналина, глюкагона, инсулина на мобилизацию и депонирование липидов. (Неустойчивость жирового обмена у детей, характер проявления и факторы, ее определяющие.)
22. Патология липидного обмена, обусловленная нарушением переваривания и всасывания жиров. Механизм желчно-каменной болезни.
23. Патология межуточного обмена липидов. Врожденные нарушения обмена: болезни Гоше, Пик-Нимана, Тей-Сакса, ксантоматоз и др.
24. Нарушения, связанные с недостаточным поступлением в организм жирорастворимых витаминов.
25. Витамин D, его влияние на обмен кальция и фосфора. Нарушения минерального обмена при рахите.
РАЗДЕЛ IX. ОБМЕН АМИНОКИСЛОТ
И ПРОСТЫХ БЕЛКОВ.
Занятие № 27
ТЕМА. АЗОТИСТЫЙ БАЛАНС. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЦЕН-НОСТЬ, ПЕРЕВАРИВАНИЕ И ВСАСЫВАНИЕ БЕЛКОВ. ГНИЕНИЕ БЕЛКОВ В КИШЕЧНИКЕ. КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА.
Цель занятия: 1.Знать процессы переваривания и всасывания белков.
2.Изучить процессы гниения аминокислот в кишечнике и обезвреживания продуктов гниения.
3.Овладеть методами количественного и качественного анализа желудочного сока.
Исходный уровень знаний:
- строение и физико-химические свойства аминокислот;
- химия и биологическая роль белков;
- заменимые и незаменимые аминокислоты;
- специфичность действия ферментов.
Содержание занятия.
I.2. Критерии биологической ценности белков.
Азотистый баланс: виды, примеры.
Физиологический минимум и оптимум белка.
Переваривание и всасывание белков: условия, отделы желудочно-кишечного тракта.
Протеолитические ферменты: название, место и механизм активации, субстратная специфичность.
Гниение аминокислот в кишечнике, обезвреживание продуктов гниения.
II.1.Работа № 1. ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТАВНЫЕ ЧАСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА И ИХ ОБНАРУЖЕНИЕ.
Наряду с нормальными компонентами в желудочном соке при ряде заболеваний могут появляться и другие вещества: молочная кислота, кровь, желчные пигменты. В клинике часто определяют эти вещества с помощью специальных реакций.
При ахлоргидрии наряду с молочной кислотой образуются летучие жирные кислоты (уксусная, масляная), т.к. под влиянием микроорганизмов в желудке развиваются процессы брожения. Кровь (кровяные пигменты) может попадать в желудочный сок при изъязвлении стенок желудка. Желчные пигменты появляются в желудке из двенадцатиперстной кишки вследствие антиперистальтики.
а) Обнаружение молочной кислоты.
Принцип метода и химизм реакции см. зан..№20, (с.73).
Порядок выполнения работы.
К 1 мл реактива Уффельмана добавить 5 кап желудочного сока, содержащего молочную кислоту.
РЕЗУЛЬТАТ:
б) Бензидиновая проба на кровь.
Принцип метода и химизм реакции.
Реакция обусловлена способностью гемоглобина катализировать окисление бензидина перекисью водорода. Бензидин при этом окисляется в парахинондиимин и жидкость приобретает синюю окраску, а при стоянии - красную. Эта реакция очень чувствительна и служит для определения минимальных примесей крови в биологических жидкостях.
+H2O2
H2N— — —NH2 HN═ ═ ═NH +2H2O
Hb
Порядок выполнения работы.
К 5 кап. бензидина прилить 5 кап. 3% раствора перекиси водорода и 5 кап. желудочного сока, содержащего кровь. Отметить окраску.
РЕЗУЛЬТАТ:
Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
КИСЛОТНОСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА.
При определении кислотности желудочного сока различают общую кислотность, общую соляную кислоту, свободную соляную кислоту и связанную соляную кислоту. Под общей кислотностью желудочного сока понимают сумму всех кислореагирующих веществ.
Принцип метода.
Общую кислотность измеряют в миллилитрах 0,1 N раствора NaOH, затраченного на нейтрализацию 1000 мл желудочного сока в присутствии индикатора фенолфталеина (зона перехода 8,3-10,0; ниже 8,3 - бесцветный, выше 10,0 - красный). Содержание свободной HCl измеряют в мл 0,1 N раствора NaOH, затраченного на нейтрализацию 1000 мл желудочного сока в присутствии индикатора диметиламиноазобензола (зона перехода рН 2,9-4,0; ниже - розово-красный, выше - желтый).
Соляная кислота, называемая " связанной ", находится в солеобразном состоянии с белками и продуктами их переваривания. Определяется путём расчёта при титровании желудочного сока в присутствии двух индикаторов (диметиламиноазобензола и фенолфталеина).
Общая соляная кислота - сумма свободной и связанной соляной кислоты.
В норме у взрослого человека показатели кислотности колеблются в следующих пределах:
общая кислотность - 40-60 ммоль/л
свободная HCl - 20-40 ммоль/л
связанная HCl - 10-20 ммоль/л
общая HCl - 30-60 ммоль/л
Порядок выполнения работы.
Отмерить пипеткой в колбочку 5 мл желудочного сока, добавить 1 кап. диметиламиноазобензола и 2 кап. фенолфталеина. При наличии в желудочном соке свободной HCl он окрашивается в красный цвет с розовым оттенком, при отсутствии ее сразу появляется желтая окраска.
Титровать свободную HCl 0,1 N раствором щелочи из микробюретки до появления желтовато-красного (оранжевого) окрашивания, результат зафиксировать (n1).
Продолжить титрование, не добавляя щелочи в бюретку до появления лимонно-желтого цвета, результат записать (n2).
Продолжить титрование до появления розового окрашивания (n3).
NB! n3 > n2 > n1.
Расчет:
n • 1000 • 0,1
X = ------------------------, где
5
X - кислотность желудочного сока;
n - количество щелочи, пошедшей на титрование желудочного сока.
NB! n=n1 - для определения свободной соляной кислоты;
n=n3 - для определения общей кислотности;
n=(n2+n3):2 - для определения общей соляной кислоты.
1000 - количество мл желудочного сока для расчета;
0,1 - кол-во мг-экв щелочи в 1 мл 0,1 N р-ра в ммоль;
5 - кол-во желудочного сока, взятого для титрования в мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОД:
Клинико-диагностическое значение.
При заболеваниях желудка кислотность может изменяться. При язвенной болезни желудка или гиперацидном гастрите содержание свободной HCl и общей кислотности увеличивается (гиперхлоргидрия). При гипацидном гастрите или раке желудка наблюдается уменьшение количества свободной HCl и общей кислотности (гипохлоргидрия). При раке желудка, хроническом гастрите отмечается полное отсутствие HCl и значительное снижение общей кислотности (ахлоргидрия). При злокачественном малокровии, при раке желудка наблюдается полное отсутствие HCl и пепсина (ахилия).
Работа в плане УИРС.
Получить у преподавателя две пробирки с клиническим материалом. Содержимое 1-ой пробирки проанализировать на содержание патологических компонентов, а образец из 2-ой пробирки оттитровать для определения показателей кислотности желудочного сока.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы.
Что такое желудочный сок?
Каков его состав в норме?
Какова роль HCl желудочного сока в пищеварении?
Какие патологические компоненты можно обнаружить в желудочном соке?
Какой реакцией открывают молочную кислоту?
Какая проба используется для выявления крови?
Чему в норме равны показатели кислотности желудочного сока?
Как называются состояния изменения кислотности?
Материал для самоподготовки. а)1 с.409-431; II, III
Занятие № 28
ТЕМА. ДЕЗАМИНИРОВАНИЕ, ТРАНСАМИНИРОВАНИЕ, ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ АМИНОКИСЛОТ. СУДЬБА a-КЕТОКИСЛОТ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ОБМЕНА БЕЛКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.
Цель занятия: 1.Изучить общие пути метаболизма аминокислот (дез-, трансаминирование, декарбоксилирование).
2.Овладеть методами качественного и количественного определения белков в моче.
Исходный уровень знаний:
- химия аминокислот;
- реакции дезаминирования, декарбоксилирования;
- классификация и номенклатура ферментов;
- строение витаминов В2,РР,В6 и содержащих их коферментов.
Содержание занятия.
I.2. Общие пути метаболизма аминокислот.
Механизм поступления аминокислот в клетку.
Дезаминирование аминокислот и его виды.
Трансаминирование аминокислот: механизм, ферменты, роль витамина В6.
Декарбоксилирование аминокислот и его виды.
Биогенные амины: строение, биологическая роль, инактивация.
II.1.Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА БЕЛОК
В МОЧЕ.
В норме белок в моче находится в следовых количествах, которые не открываются обычными реакциями, применяемыми в клинической лаборатории. При ряде заболеваний с мочой выделяется заметное количество белка, начиная с долей грамма до 25 г в сутки. Появление белка в моче называется протеинурией или альбуминурией, поскольку моча содержит, в основном, сывороточный альбумин.
Протеинурия может быть истинной и ложной. При истинной (или почечной) протеинурии белок сыворотки крови попадает в мочу через почки. Случайная (или ложная) протеинурия наблюдается при попадании в мочу слизи, крови, гноя, но не из почек, а из мочевыводящих путей.
Принцип метода.
Для обнаружения белка в моче применяют реакции осаждения с помощью азотной или сульфосалициловой кислот. Последняя - самая чувствительная.
Порядок выполнения работы.
К 1 мл мочи прилить 3 кап 20% раствора сульфосалициловой кислоты.
РЕЗУЛЬТАТ:
Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В МОЧЕ ПО МЕТОДУ БРАНДБЕРГА-РОБЕРТСА-СТОЛЬНИКОВА.
Принцип метода.
Метод основан на реакции Геллера с концентрированной азотной кислотой. Экспериментально установлено, что растворы, содержащие 0,033% белка (т.е. 0,033 г/л), дают мутное белое колечко в конце 2-й - начале 3-й минуты после наслаивания раствора белка на азотную кислоту. Толщина и быстрота появления кольца зависит от количества белка.
Порядок выполнения работы.
В пробирку налить 1 мл 50% раствора азотной кислоты, туда же осторожно по стенке добавить из пипетки 1 мл мочи. За счет меньшей относительной плотности моча наслаивается на кислоту. Если кольцо появилось сразу, повторить реакцию с мочой, разведенной в 10, 20, 30 и более раз до получения отрицательного результата.
РАСЧЕТ. Количество белка (Х) определяют по формуле
Х= n • 0,033 г/л, где
n - разведение мочи.
РЕЗУЛЬТАТ:
III.2. Контрольные вопросы.
Как можно открыть белок в моче?
Каков принцип количественного определения белка в моче?
Какие виды протеинурии Вы знаете?
Материал для самоподготовки. а)1 с.431-451; II, III
Занятие № 29
ТЕМА. ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ АММИАКА В ОРГАНИЗМЕ. ОРНИТИНОВЫЙ ЦИКЛ МОЧЕВИНООБРАЗОВАНИЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ОБМЕНА БЕЛКОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ.
Цель занятия: 1.Изучить пути образования и обезвреживания аммиака.
2.Освоить методы количественного определения мочевины и остаточного азота в сыворотке крови.
Исходный уровень знаний:
- химия аминокислот;
- реакции дез-, трансаминирования аминокислот;
- классификация и номенклатура ферментов;
- строение витаминов В2, РР, В6 и содержащих их коферментов.
Содержание занятия.
I.2.Пути образования и обезвреживания аммиака в организме.
Способы обезвреживания аммиака.
Синтез мочевины: химизм, ферменты, нарушения.
II.1.Работа № 1. КОЛИЧЕСТВЕНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕ-ВИНЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (набор "Биотест")
Принцип метода.
Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и ионов Fe3+ в сильнокислой среде красный комплекс, который фотометрируют.
Порядок выполнения работы.
Приготовить рабочий раствор, смешав одну долю раствора Реактива с одной долей раствора серной кислоты.
Осадить сывороточные белки: в центрифужную пробирку налить 1мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), добавить 0,1 мл сыворотки и центрифугировать 10 мин при 1500 об/мин. Для анализа использовать супернатант.
Так же разбавить эталонный раствор: к 1мл 5% раствора ТХУ добавить 0,1 мл эталонного раствора мочевины.
| Реактивы (мл) | Проба | Эталон | Раствор сравнения |
| Рабочий раствор | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| Супернатант | 0,1 | - | - |
| Эталонный раствор | - | 0,1 | - |
| Дистиллированная вода | - | - | 0,1 |
Пробирки закрыть крышкой из фольги и нагреть точно 10 мин на кипящей водяной бане, охладить (2-3мин) в струе холодной воды и не позже, чем через 15 мин измерить оптическую плотность пробы и эталона против раствора сравнения в кювете 1 см при 490-540 нм (светофильтр №5, зеленый).
РАСЧЕТ. Концентрацию мочевины (Х) рассчитывают по формуле:
А
Х= ― • 16,65 ммоль/л, где
В
А - оптическая плотность пробы,
В - оптическая плотность эталона.
Можно сделать перерасчет мочевины в азот мочевины умножением на коэффициент 0,466.
Нормальное содержание мочевины в сыворотке крови составляет 2,50-8,32 ммоль/л; в моче - 333-583 ммоль/сут.
Верхняя граница содержания мочевины зависит от приема белков с пищей. При приеме белков более 2,5 г/кг веса в сутки содержание мочевины в сыворотке может быть до 10 ммоль/л.
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТА-ТОЧНОГО АЗОТА ПО МЕТОДУ АССЕЛЯ.
Наряду с белками в крови содержатся азотсодержащие вещества небелкового характера. После удаления белков крови осаждением безбелковый фильтрат содержит еще азот, носящий название "остаточного азота" и слагающийся из азота мочевины, мочевой кислоты, креатина, креатинина, индикана, аминокислот и других веществ.
Принцип метода.
Безбелковый фильтрат минерализуется в присутствии серной кислоты и пергидроля. При этом весь азот органических соединений превращается в сернокислый аммоний, который определяется колориметрически с реактивом Несслера.
Порядок выполнения работы.
В пробирку отмерить 2,8 мл фосфорномолибденового реактива, добавить микропипеткой 0,2 мл крови, взболтать и оставить на 30 мин. Осадок белка отфильтровать. К 1 мл фильтрата прилить 0,05мл (2 кап) концентрированной серной кислоты. Во 2-ую пробирку поместить 2 кап концентрированной H2SO4 и содержимое обеих пробирок сжечь на песочной бане (При нагревании жидкость в 1 пробирке буреет). Обе пробирки снять с огня, остудить, добавить по 2-3 кап. пергидроля и снова нагреть до полного обесцвечивания. После сжигания пробирки охладить и прибавить по 10 мл воды, 0,2 мл 5
