1. Подбор штаммов возбудителя;
2. Культивирование соответствующих штаммов на питательных средах;
3. Стандартизация до определенной концентрации микробов в 1 мл;
4. Инактивация методом нагревания;
5. Гипериммунизация животных (лошадей, волов, овец, кроликов);
6. Взятие крови через 8-10 дней после последней инъекции антигена;
7. Отделение сыворотки;
8. Консервирование сыворотки (фенол, тиомерсал);
9. Отстаивание в течение 2 месяцев;
10. Фильтрация через бактериальные фильтры;
11. Фасовка, лиофильная сушка;
12. Контроль: стерильность, активность, специфичность.
Аллергены
Микробные белки и продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Применение основано на явлении инфекционной аллергии, т.е. гиперчувствительности замедленного типа в ответ на введение в ранее инфицированный организм гомологичного антигена.
Бруцеллин ВИЭФ; ППД-туберкулин для млекопитающих, для птиц, КАМ-аллерген; Маллеин – для диагностики сапа у лошадей.
Изготовление аллергенов. Каждый аллерген готовится по своей технологии. Маллеин:
Стерильный фильтрат убитой нагреванием бульонной культуры сапной бактерии. Имеет вид прозрачной светло-желтой стерильной жидкости. Представляет собой продукт жизнедеятельности сапных культур. Для получения маллеина вирулентные штаммы засевают в колбы с МПБ с добавлением глицерина, выдерживают при температуре 37 ºС в течение 4 месяцев. Автоклавируют для инактивации возбудителя. Осаждают. Фильтруют через бактериальные фильтры. Разливают Контроль на стерильность, безвредность, специфичность, активность.
Диагностические бактериофаги
Применение бактериофагов основано на явлении специфического лизиса фагами соответствующих видов или вариантов бактерий. По известному бактериофагу можно определить вид или вариант бактерий.
Для диагностики сибирской язвы выпускают 2 фага:
1. Сибиреязвенный фаг «К» ВИЭВ;
2. Сибиреязвенный фаг «Гамма» МВА.
Для диагностики листериоза выпускают 2 бактериофага:
1. L2A;
2. L4A.
Для диагностики бруцеллеза: Тб. Стафилококковые фаги. О-сальмонеллезный фаг. Коли-фаги.
Общие принципы приготовления диагностических бактериофагов
1. Культивирование на питательных среда авирулентных штаммов возбудителей;
2. Добавление соответствующих фагов для лизиса. Активность фага должна быть не ниже 10-8;
3. Выдерживают при температуре 37 ºС 10-17 часов;
4. Фильтрация через стерилизующие асбестовые пластинки;
5. Фасовка по флаконам;
6. Контроль (стерильность, специфичность, активность).
Лечебно-профилактические биопрепараты
Применяются для профилактики и лечения больных животных.
Гипериммунные сыворотки (моновалентные и поливалентные; антибактериальные, противовирусные, антитоксические, сыворотка реконвалесцентов), гамма-глобулины, бактериофаги.
Гипериммунные сыворотки
Биологические иммунные препараты, полученные из сыворотки крови животных, гипериммунизированных бактериальными или вирусными антигенами и содержащие большое количество антител против какого-либо возбудителя.
Антибактериальные, противовирусные, антитоксические, смешанные, реконвалесцентов
Моновалентные – против 1 вида (сероварианта), поливалентные – против нескольких, либо против одного вида возбудителя у разных видов животных.
Принцип изготовления (на предприятиях биологической промышленности)
1. Подбор продуцентов (чаще лошади, также волы, ослы, мулы, реже свиньи, овцы, кролики), приобретают их в благополучных по инфекционным и кровепаразитарным заболеваниям;
2. Карантинирование животных–продуцентов, в это же время проводят их всесторонний осмотр;
3. Создание грунд-иммунитета (вакцинируют соответствующей вакциной);
4. Гипериммунизация животных (многократное парентеральное введение антигена в нарастающих дозах);
5. Взятие крови (у лошадей 16-20 мл на 1 кг ЖМ, КРС 16 мл/кг, овцы 14 мл/кг, свиньи 11 мл/кг). Первое взятие – через 7-10 дней после последнего введения антигена;
6. Получение сыворотки: кровь в термостат при температуре 37 ºC на 3 часа, чтобы свернулась, затем в прохладное место (8 ºС) на 24-48 часов. Образовавшуюся сыворотку сливают в стерильную посуду;
7. Консервирование (фенол, тиомерсал);
8. Отстаивание в течение 2 месяцев;
9. Фильтрация через бактериальные фильтры;
10. Фасовка;
11. Контроль (стерильность, безвредность, активность).
Создают быстрый иммунитет (в течение суток), но он является пассивным, непродолжительным (10-14 дней).
Лечебные дозы в 5-10 раз больше профилактических. Большие дозы сыворотки вводятся в разные точки. Если состояние тяжелое – можно ввести внутривенно, но предварительно подогреть. Могут вызвать анафилактический шок или подъем температуры.
Иммунные глобулины
Представляют собой 10% водный раствор глобулиновой фракции белка, выделенной из соответствующей иммунной сыворотки. Иммунные глобулины – концентрат специфически активных белков (иммуноглобулинов), освобожденных от балластных белковых фракций.
Получают из гипериммунных сывороток.
В гипериммунной сыворотке содержатся альфа-, бета-, гамма-глобулины, альбумины. При изготовлении иммунных глобулинов из гипериммунной сыворотки осаждают балластные белки (альфа-, бета-глобулины, альбумины). Методов осаждения очень много. Самый распространенный – фракционное осаждение белков этанолом при низких температурах (3 этапа). Другие методы: высаливание нейтральными солями, для этого используют сернокислый аммоний, сульфат натрия, гипосульфит. Риваноловый метод. Диализ, ферментация и т.д.
Иммуноглобулины в меньших дозах оказывают больший лечебный или профилактический эффект по сравнению с иммунными сыворотками.
Контроль иммунных глобулинов: стерильность, активность, безвредность.
Бактериофаги
Могут быть моно-, би- и полифагами.
Коли-гертнер фаг.
Принцип изготовления
Напоминает принцип изготовления диагностических, но есть разница.
1. Культивирование на питательных средах фагочувствительных штаммов;
2. Добавление фагов, 6-10 часов для лизиса;
3. Фильтрация;
4. Консервирование смесью хинозола и фенола;
5. Фасовка;
6. Контроль (стерильность, безвредность, активность).
Активность: десятичные разведения до 10-11, в каждую пробирку по 0,05 мл соответствующей культуры. термостат на 24 часа (37 градусов). Титр начинают определять через 6 часов. Титр – наибольшее разведение бактериофага, в котором бульон остается прозрачным. Фаг считается активным при титре не ниже 10-7.
Туберкулинизация животных (методы, место введения, доза, учёт реакции)
В настоящее время прижизненная диагностика туберкулёза затруднена из-за широкой распространенности атипичных микобактерий. Для дифференциации используют симультанную пробу с КАМ-аллергеном.
Яков, лошадей, буйволов, свиней с 2 месяцев. Верблюдов с 1 года, маралов, оленей, пушных верей и птиц с 6 мес. Коров, буйволов с 2 месяцев. Коров, буйволов, яков, верблюдов исследуют независимо от периода беременности. Коз, овец, свиноматок, лошадей, собак, самок пушных зверей – не ранее месяца после родов. Не разрешается исследовать животных аллергическим методом на туберкулез в течение 3 недель после вакцинации или после обработки против гельминтов.
Однократна внутрикожная туберкулиновая проба. Применяется у КРС в благополучных хозяйствах, также у свиней, верблюдов, оленей, маралов, буйволов, собак, кошек, пушных зверей, птиц. Туберкулин вводят в дозе 0,2 мл КРС, буйволам в области средней трети шеи. Быкам-производителям туберкулин вводят в подхвостовую складку, верблюдам в кожу брюшной стенки в области паха, свиньям с наружной поверхности уха, отступя 2 см от его основания. 2-3 месячным поросятам туберкулин можно вводить в кожу поясницы на расстоянии 5-8 см от позвоночника. Овцам, козам туберкулин вводится под кожу нижнего века. Собакам и пушным зверям, кроме норок, туберкулин вводится в области внутренней поверхности бедра. Норкам вводят интрапальпебрально, то есть в верхнее веко. Кошкам туберкулин вводят в области внутренней поверхности уха, курам – в кожу бородки, индейкам в подчелюстную сережку, гусям и уткам в подчелюстную складку. Учитывают и оценивают реакцию на введение туберкулина у КРС, буйволов, яков, верблюдов, маралов, оленей через 72 часа. У коз, овец, свиней, собак, кошек, пушных зверей через 48 часов. У птиц – через 30-36 часов. У животных, инфицированных микобактериями, реакция на туберкулин выражается в возникновении разлитой припухлости, тестоватой, не имеющей четких границ. Это сопровождается гиперемией и болезненностью кожи. В некоторых случаях припухлость бывает плотной, безболезненной, имеет четкие границы. При обнаружении припухлости у КРС, буйволов, яков, верблюдов, оленей, маралов кутиметром измеряют толщину кожной складки и сравнивают с толщиной складки неизмененной кожи вблизи места введения туберкулина. Животных считают реагирующими на туберкулин при утолщении кожной складки на 3 мм и более. Быков-производителей, овец, коз, свиней, собак, кошек, пушных зверей и птиц считают реагирующими при образовании припухлости в месте введения туберкулина.
Двукратная внутрикожная туберкулиновая проба применяется у КРС, буйволов, яков, верблюдов, маралов, оленей в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. В день учета реакции животным, не реагировавшим на первое введение туберкулина в дозе 10000 МЕ в 0,2 мл, вводят туберкулин повторно в той же дозе и в то же место, реакцию учитывают через 24 часа. Животных считают реагирующими при утолщении кожной складки на 5 мм и более.
Глазная проба (офтальмопроба) применяется при исследовании лошадей и у КРС. При этой пробе 3-5 капель туберкулина наносят на конъюнктиву глаза при оттянутом нижнем веке. Через 5-6 дней вводят туберкулин повторно. После первого введения реакцию учитывают через 6, 9, 12, 24 часа. После второго введения реакцию учитывают через 3, 4, 6, 9, 12 часов. Животных считают реагирующими при образовании слизисто-гнойного или гнойного секрета, накапливающегося в конъюнктивальном мешке или вытекающего в виде шнура из внутреннего угла глаза. Конъюнктива при этом гиперемирована и отечна.
Внутривенная туберкулиновая проба. Применяется только у взрослого крупного рогатого скота, за исключением коров за месяц до отела и в течение месяца после него. Этим методом нельзя исследовать животных с температурой тела выше 39,5 градусов. Туберкулин вводят внутривенно в дозе 1 мл на каждые 100 кг живой массы, после введения начинают измерять температуру у животного: через 3, 6, 9 часов. Реагирующими считают животных с повышением температуры тела на 1 ºС и более.
Если в благополучном хозяйстве при проведении плановых аллергических исследований КРС выявляют реагирующих животных, их дополнительно исследуют либо офтальмопробой, либо внутривенной туберкулиновой пробой. Реагирующих на эти пробы животных подвергают комиссионному диагностическому убою. При обнаружении типичных для туберкулеза патологических изменений диагноз считают установленным. Если характерные изменения органов и тканей не обнаружены, проводят бактериологические исследования биоматериала от убитых животных. При выделении культур микобактерий бычьего, человеческого вида или при положительной биопробе на лабораторных животных диагноз также считается установленным. Ели реакция на офтальмопробу или внутривенное введение отрицательны, всех животных данного хозяйства проверяют симультанной аллергической пробой. В случае подтверждения факта сенсибилизации животных атипичными микобактериями стадо считают благополучным по туберкулезу, и последующие плановые исследования проводят с применением симультанной пробы.
При выявлении в благополучном хозяйстве реагирующих на туберкулин свиней, коз, овец проводят диагностический убой 3-5 животных с наиболее выраженными реакциями. Независимо от наличия или отсутствия патологических изменений отбирают материал для бактериологического исследования. В случае выделения микобактерий бычьего, человеческого вида или положительной биопробы туберкулез считают установленным.
Если у павшей или убитой птицы обнаруживают свойственные туберкулезу патологические изменения, делают бактериоскопию биоматериала. При положительном результате диагноз считаю установленным.
У животных других видов туберкулез устанавливают на основании результатов патологоанатомического и бактериологического исследования.
