История открытия и изучения ферментов. Особенности ферментативного катализа.

 

История открытия и изучения ферментов. Ферменты (энзимы, enzymes) - са­мый крупный и наиболее специализированный класс белковых, молекул. Они представляют собой тот рабочий аппарат, при помощи которого реализуется ге­нетическая информация клетки.

История биохимии - это в значительной степени история изучения фермен­тов. В конце XIX столетия возникают первые представления о ферментах как о биологических катализаторах, однако вначале предполагали, что их деятель­ность неотделима от живых клеток (1860, Пастер). В 1987 г. Э. Бухнеру удалось показать, что ферменты, полученные в виде экстракта из живых клеток, способ­ны катализировать спиртовое брожение. Так было впервые доказано, что основ­ные метаболические процессы, связанные с производством энергии, могут функционировать независимо от клеточной структуры.

Первым обнаруженным ферментом, полученным в чистом кристаллическом виде, была уреаза - фермент, разрушающий мочевину. Впервые выделение это­го фермента провел Дж. Самнер и привел доказательства того, что- фермент име­ет белковую природу. В тот период его мнение не поддерживалось научным со­обществом. Представление о белковой природе ферментов стало общепринятым после того, как Нортроп в 1936 г получил кристаллы пепсина, трипсина и химотрипсина.

В настоящее время идентифицировано около 2000 различных ферментов. Почти все ферменты - белки, однако, в последние годы обнаружены рибонук­леиновые кислоты с гидролитической активностью, получившие название - рибозимы. катализирующие гидролиз фосфодиэфирных связей нуклеиновых ки­слот.

 

Особенности ферментативного катализа. Ферменты (биологические катализа­торы) - молекулы, ускоряющие химические реакции во многие миллионы раз. В ходе реакции ферменты не расходуются и после реакции они остаются в неиз­мененном виде, хотя в ходе самой реакции их структура может претерпевать временные изменения. В живых клетках ферментами чаще всего являются глобулярные белки.

Скорость реакции, катализируемой ферментами, значительно выше скоро­сти этой же реакции в присутствии неорганического катализатора и в 10⁶-10¹² раз и более выше скорости спонтанной некатализируемой реакции.

Карбоангидраза содержится в эритроцитах и катализирует реакцию образо­вания угольной кислоты Н₂С0₃ из С0₂ и Н₂0. Карбоангидраза - один из наибо­лее «быстрых» ферментов, который характеризуется наибольшим числом обо­ротов. За 1 секунду этот фермент успевает провзаимодействовать с 10^б молекул С0₂ и 10 молекул воды. Карбоангидраза, карбоксипептидаза А, стафилококко­вая нуклеаза ускоряют соответствующие реакции, по сравнению со спонтанны­ми некатализируемыми реакциями, в 7,7-10⁶; 1,9-10² и 5,6-10¹⁴ раз соответст­венно.

Ферменты, как и все катализаторы, снижают энергию активации катали­зируемой ими реакции и направляют медленно текущую реакцию по иному пути, характеризующемуся более низкой энергией переходного состояния.

В отсутствие фермента, когда скорость спонтанного превращения субстрата определяется лишь температурой, молекулы субстрата сталкиваются самым не­предсказуемым образом, благодаря чему приобретают дополнительные порции энергии, при этом возникают самые разные переходные состояния. Поэтому ос­новная реакция часто сопровождается множеством побочных реакций. При ферментативном катализе, напротив, катализируется только одна из всех воз­можных реакций.

Ферменты обладают уникальным свойством - субстратной специфично­стью. благодаря которой только один или несколько субстратов связываются в активном (преимущественно гидрофобном) центре фермента. При фермент-субстратном взаимодействии происходит:

1) сближение и необходимая ориентация субстратов или реагирующих групп одного субстрата;

2) удаление гидратной оболочки субстрата (в итоге внутри активного цен­тра создаются совсем другие условия, чем в растворе);

3) ослабляется разрываемая связь между атомами субстрата.

При связывании происходит индуцированное субстратом конформационное из­менение фермента и его активного центра, образуется фермент-субстратный комплекс. Индуцированное соответствие обеспечивает эффективный фермента­тивный процесс, но не вносит решающий вклад в увеличение скорости реакции. Только сближением и ориентацией реагирующих групп нельзя объяснить то ог­ромное увеличение скорости реакции, которое дают ферменты. Установлено, что в значительной мере каталитическая активность ферментов связана с их не­посредственным участием в самих процессах разрыва и образования новых свя­зей. Поэтому еще одним процессом ускорения ферментативных реакций являет­ся:

4) стабилизация переходного состояния, образующегося в результате взаи­модействия между субстратом (S) и аминокислотными остатками активного центра фермента (Е) или кофактором, достижение которого требует значительно меньшей энергии активации. Z - переходное состояние, Р - продукт реакции.

E+S ó ES ó EZ ó EP ó E+P

Диапазон эффективного функционирования ферментов относительно неве­лик (нормальные физиологические условия). Конформационная лабильность белков (способность к небольшим изменениям нативной конформации), затра­гивающая в том числе и их активный центр, объясняет тот факт, что при откло­нении температуры и рН от определенных оптимальных значений снижается ка­талитическая активность ферментов.

В начальный период исследования ферментов предполагали, что между актив­ным центром фермента и субстратом существуют строго комплементарные взаимоотношения. Однако впоследствии эти взгляды изменились.

Концепция Кошланда. В настоящее время фермент-субстратное взаимодейст­вие понимают не как строго комплементарное, а как лишь примерное. Т.е. меж­ду активным центром фермента и субстратом, безусловно, существует сродство, однако оно обеспечивается невысокой степенью комплементарности. По мере сближения и усиления взаимодействия активного центра фермента с субстратом степень комплементарности значительно возрастает. В тот момент, когда суб­страт полностью заполняет собой активный центр, максимально возрастает сте­пень разрыхления его химических связей, и он преобразуется в промежуточное вещество (Z). В дальнейшем промежуточное вещество Z, находящееся к актив­ном центре фермента, получает дополнительные порции (кванты) тепловой энергии и преобразуется в продукт реакции. Продукт реакции (Р) покидает ак­тивный центр фермента, поскольку связан с активным центром менее прочно.

E+S ó ES ó ES* ó ES** ó ES*** ó EP ó E+P

Такая запись ферментативного процесса отражает то обстоятельство, что суб­страт в активном центре фермента приобретает возбужденное состояние после­довательно, в несколько этапов.

И действительно, исследования реальных ферментов показали, что актив­ный центр фермента лучше согласован со структурой субстрата в переходном состоянии, чем со структурой субстрата в свободной форме. Суммарный эффект фермент-субстратного взаимодействия заключается в уменьшении энергии ак­тивации и снижает энергетический барьер на пути реакции.

 

Специфичность действия ферментов. Классификация и номенклатура ферментов. Изоферменты. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, pH, концентраций фермента и субстрата. Единицы измерения активности и количества ферментов.

 

Специфичность действия ферментов. Для ферментов характерна высокая специфичность по отношению к катализируемой реакции (реакционная или ка­талитическая специфичность) и соответствующим субстратам (субстратная спе цифичность). Реакционная специфичность заключается в том, что фермент ка­тализирует определенный тип каталитических превращений одного или не­скольких субстратов по одному из возможных путей его превращения.

Субстратная специфичность подразумевает способность каждого фермента взаимодействовать только с одним или несколькими определенными субстрата­ми. Различают специфичность

 

Абсолютную (Фермент имеет актив­ный центр, который комплементарен только одному субстрату. Аргиназа, катализирующая расщепление аргинина на орнитин и мочевину, аспартаза, катализирующая реак­цию

Фумарат + NH₄⁺ Аспартат + Н⁺⁾,

 

Групповую (относительную) (Фермент способен ката­лизировать однотипные реакции с небольшим количеством структурно схожих субстратов. Гексокиназа катализирует присоединение фосфатной группы к ряду шестиуглеродных Сахаров: глюкозе, маннозе, фруктозе, галакто­зе и др.),

 

Стереоспецифичность (Фермент способен ката­лизировать превращения только одного из двух стереоизомеров. Ферменты метаболизма уг­леводов имеют специфич­ность к D-, а не к L-моносахаридам.) и, реже,

 

Двойственную (Фермент взаимодейст­вует с резко различаю­щимися по структуре субстратами. Ксантиноксидаза окисляет не только гипоксантин и ксантин, но и альдегиды.) специфичность.

 

Например, альфа-амилаза (фермент, имеющий важное значение в клинике при диагностике острого панкреатита), гидролизует внутренние альфа-1,4-гликозидные связи крахмала, гликогена и других полимеров глюкозы, но не гидролизует ни альфа-1,6-гликозидные связи в этих субстратах, ни бета-1,4-гликозидные связи между остатками глюкозы в целлюлозе.

Глюкозо-6-фосфат под действием четырех различных ферментов печени, каждый из которых катализирует соответствующую реакцию, превращается в четыре различных продукта (глюкоза, глюкозо-1-фосфат, фруктозо-6-фосфат и 6-фосфоглюконолактон), что лежит в основе различных транспортных и мета­болических путей.

Глюкоза поступает из печени в кровь и транспортируется к нервным и мышеч­ным клеткам. Глюкозо-1-фосфат - необходим для преобразования галактозы в глюкозу и используется в качестве промежуточного соединения - УДФ-глюкозы (уридиндифосфат-глюкоза). Фруктозо-6-фосфат вступает в гликолиз для образования пирувата (пировиноградной кислоты). 6-Фосфоглюконолактон - поступает в пентозный путь для образования пятиуглеродных Сахаров и НАДФН.

Таким образом, четыре различных продукта, образующихся из глюкозо-6-фосфата определяют различные пути использования глюкозы.

Высокая субстратная специфичность ферментов лежит в основе ступенчатости биохимических процессов. Ступенчатость биохимических процессов дает воз­можность тонко регулировать эти процессы, постепенно порциями освобождать энергию (при катаболических процессах) и легче обеспечивать энергией про­цессы, ведущие к усложнению структуры молекул (при анаболизме).

 

Классификация и номенклатура ферментов. В основе классификации фер­ментов лежит тип катализируемой ферментативной реакции (реакционная спе­цифичность).

Система классификации учитывает реакционную и субстратную специфичности ферментов. В каждом из шести главных классов объединены ферменты, обла­дающие одинаковой реакционной специфичностью. Подклассы и подподклассы сформированы с учетом преобразуемой группы субстрата и других признаков. Каждый фермент получил свой четырехзначный классификационный номер. В соответствии с классификацией все ферменты получили систематические на­именования, однозначно характеризующие катализируемую ими реакцию: они составляются из названия субстрата (или субстратов) реакции и окончания "- аза".

1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ - сложные белки. В качестве акцептора электронов используются коферменты НАД⁺, НАДФ⁺, ФАД, ФМН, гем, дигидробиоптерин, ионы металлов.

Тип реакции: катализируют окислительно-восстановительные реакции с уча­стием двух субстратов путем переноса электронов или атомов водорода с одно­го субстрата на другой.

2. ТРАНСФЕРАЗЫ - как сложные, так и простые белки. Подразделяются на подклассы в зависимости от переносимой группы. Коферментами могут быть коэнзим А, ТГФК, пиридоксальфосфат, различные нуклеозиддифосфаты (АДФ, УДФ, ЦДФ, ГДФ, ТДФ), биотин, метилкобаламин.

Тип реакции: катализируют перенос функциональных групп от одного субстрата на другой. Переносят группы: одноуглеродные, альдегидные или кетонные, ацильные, гликозильные, а также группы, содержащие фосфор или серу. Важнейшие группы ферментов: аминотрансферазы, сульфотрансферазы, фосфотрансферазы (киназы), гликозилтрансферазы, переносчики одноуглеродных групп (C₁-трансферазы).

3. ГИДРОЛАЗЫ - большинство ферментов - простые белки, лишь немногие содержат ион металла. Подразделяются на подклассы в зависимости от расще­пляемой связи.

Тип реакции- гидролиз, (расщепление ковалентной связи с присоединением молекулы воды по месту разрыва). Гидролизуют сложные биохимические структуры до низкомолекулярных веществ, необходимы в процессе переварива­ния пищи. Важнейшие группы ферментов: эстеразы, гликозидазы, пептидазы, амидазы.

4. ЛИАЗЫ - как простые, так и сложные белки; коферментами могут быть пи-ридоксальфосфат, ТДФ. Подразделяются на подклассы в зависимости от приро­ды образуемой или расщепляемой связи.

Тип реакции: расщепляют или образуют двойные связи (пи-связи) без участия окисления или гидролиза: отщепляют от субстратов негидролитическим путем определенные группы, при этом выделяются простейшие вещества (С0₂, Н₂0, NH₃, H₂S), а также катализируют отдельные обратные реакции синтеза (синтазы). Важнейшие группы ферментов: декарбоксилазы, дегадратазы, гидратазы, альдолазы, синтазы.

5. ИЗОМЕРАЗЫ - большая их часть является простыми белками, но есть и сложные, которые содержат в качестве кофермента пиридоксальфосфат, дезоксиаденозилкабаламин, НАД⁺. Подразделяются на подклассы в зависимости от типа изомеризации.

Изомеразы катализируют реакции изомеризации, в частности взаимопревраще­ния альдоз и кетоз, перемещение двойных связей внутри молекулы.

Если изомеризация состоит во внутримолекулярном переносе групп, фер­мент называют мутазой.

6. ЛИГ АЗЫ (СИНТЕТАЗЫ).- большинство этих ферментов простые белки, но некоторые (образующие С—С связи) содержат биотин. Подклассы зависят от природы образующейся связи.

Тип реакции - соединяют две молекулы за счет разрыва макроэргических свя­зей. Если реакция сопровождается разрывом связей в АТФ или других нуклеозидтрифосфатах, ферменты называется лигазами или синтетазами {А}, в слу­чае разрыва других макроэргических связей (например тиоэфирной связи в мо­лекуле ацетил-КоА) ферменты называют синтазами (4-й класс, лиазы). {Б}.

 

Изоферменты - ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию и обладаю­щие одинаковой субстратной специфичностью, но различающиеся каталитиче­ской активностью, условиями активации, видом связи апофермента с коферментом, физико-химическими свойствами (молекулярной массой, изоэлектрической точкой, электрофоретической подвижностью). Изоферменты одного семейства неравномерно представлены в разных тканях и органах на разных стадиях онто­генеза, что обеспечивает неодинаковую интенсивность соответствующей реак­ции, т.е. изоферменты выполняют своеобразную роль регуляторов метаболиче­ских путей.

Существование изоферментов чаще всего имеет генетическую природу - они кодируются разными генами (как у а-амилазы), или состоят из разных наборов субъединиц (например у лактатдегидрогеназы). Кроме того, полипептидная цепь фермента может быть подвергнута в разных органах различным посттранс­ляционным изменениям изофермента (фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование) - в этом случае говорят о изоформах фермента.

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) представлена в различных органах рядом изоферментов, состоящих из четырех субъединиц двух типов - М и Н и катали­зирует реакцию:

                Лактатдегидрогеназа

Пируват + НАДН ó Лактат + НАД⁺ + Н⁺

Реакция образования лактата развивается только в анаэробных условиях и необходима для обеспечения непрерывности гликолитического процесса (ске­летные мышцы, печень). В анаэробных условиях гликолиз становится единст­венным процессом обеспечения клеток энергией в форме АТФ.

 

Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН, кон­центрации фермента и субстрата.

Скорость ферментативной реакции (активность фермента) определяется изме­нением количества вещества субстрата или продукта реакции за единицу време­ни в единице объема. Она зависит от концентраций фермента, субстрата, кофак­тора (если он присутствует в данном ферменте), продуктов реакции; от рН сре­ды, температуры, а так же, если фермент обладает групповой субстратной спе­цифичностью, и от структуры субстрата. Влияет на скорость реакции присутст­вие ингибиторов или активаторов.

 

Температурная зависимость скорости ферментативной реакции всегда имеет один максимум, который возникает как результат действия двух про­тивоположно направленных факторов.

1. С ростом температуры увеличивается скорость реакции, поскольку повыша­ется скорость достижения переходного состояния субстрата.

2. С повышением температуры увеличивается вероятность денатурации молеку­лы фермента и разрушения структуры активного центра, что ведет к инактива­ции фермента и снижает скорость реакции.

Для ферментов организма человека температурный оптимум +37-38°С, у грызу­нов +40°С, у птиц +42 °С. Ферменты, выделенные из морских микроорганизмов, живущих в подводных горячих вулканических источниках (так называемые черные курильщики) имеют температурный оптимум +95°С. Чувствительность фермента к температурной денатурации называется термола­бильность. Термолабильность ферментов в зрелых и малодифференцированных клетках различается. Более термолабильны ферменты из малодифференциро­ванных клеток, в частности, клеток опухолевых тканей. Предпринимаются по­пытки использования эффекта температурной денатурации белков для лечения опухолевых заболеваний человека (метод управляемой гипертермии).

 

Зависимость скорости ферментативной реакции от величины рН обуслов­лена влиянием рН раствора на ионизацию функциональных групп в активном центре фермента, поверхностных группировок фермента и функциональных групп субстрата.

Отклонение рН от оптимального значения приводит к изменению конформации фермента и его активного центра, а также субстрата, в итоге нарушается взаи­модействие субстрата и кофермента с активным центром фермента. При значи­тельном отклонении от оптимального значения рН ферментативная активность утрачивается из-за денатурации фермента.

Большинство внутриклеточных ферментов человека имеет оптимум рН в ней­тральной области. Однако есть исключения: секретируемые ферменты желудоч­но-кишечного тракта пепсин и трипсин имеют оптимум рН 2,0 и 8,0 соответст­венно. Столь существенное различие в этом параметре у пепсина и трипсина обеспечивает непрерывность пищеварения в ходе эвакуации химуса из желудка в 12-перстную кишку.

Холинэстераза, локализованная на постсинаптической мембране нейрона, на­против, чрезвычайно устойчива к изменению кислотности синаптического мик­роокружения и сохраняет ферментативная активность в широком диапазоне рН (рис. 13). Причина этого явления в том, что один из продуктов реакции распада ацетилхолина - ацетат относительно медленно поступает в нервную клетку, и в области синапса при его активном функционировании может существовать вы­сокая локальная концентрация ацетата существенно изменяющего рН среды.

 

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермен­та и субстрата. При увеличении концентрации фермента (если концентрация субстрата значительно превышает концентрацию фермента и не изменяется) скорость реакции увеличивается линейно. Зависимость между скоростью реак­ции и концентрацией фермента прямо пропорциональная V=k([S]). Такой под­ход не позволяет дать количественные характеристики фермента. Однако такая возможность возникает, если изменять концентрацию субстрата, при постоян­ной концентрации молекул фермента.

При постоянной концентрации фермента скорость реакции по мере увели­чения концентрации субстрата увеличивается гиперболически. Зависимость V=k(l/[S]), достигая предельной максимальной скорости (кривая Михаэлиса).

Константа Михаэлиса (Кm) численно равна той концентрации субстрата, при ко­торой скорость реакции составляет половину максимальной. Величина Кm - ха­рактеристика каталитической активности фермента, чем она меньше, тем выше активность фермента.

Уравнение Михаэлиса-Ментен: V= Vmax [S]/ Km+[S]

При низкой концентрации субстрата [S] скорость ферментативной реакции V определяется частотой столкновений молекул субстрата S и фермента Е. При повышении [S] количество фермент-субстратных комплексов [ES] возрастает, а вместе с этим увеличивается и скорость реакции. При полном насыщении суб­стратом молекул фермента дальнейшее увеличение концентрации субстрата [S] уже не вызывает увеличение скорости реакции. Графически такая кинетическая зависимость описывается гиперболической кривой. Кинетическую зависимость такого вида называют кинетикой Михаэлиса-Ментен, а все подчи­няющиеся этой модели ферменты - ферментами Михаэлиса-Ментен. Долгое время они были единственными известными и поэтому получили название «классических» ферментов.

Каждый фермент характеризуется максимальной скоростью Vmax и константой Михаэлиса Кm. Это главные количественные характеристики фермента. Для практического определения этих кинетических параметров всегда используют координаты Лайнуивера-Бэрка. Главная причина этого состоит в том, что в прямых координатах никогда невозможно точно определить Vmax и Кm.

 

Единицы измерения активности и количества ферментов. Активность фермента определяют по увеличению скорости соответствующей каталитиче­ской реакции по сравнению с некаталитической.

Скорость реакции определяют как изменение концентрации субстрата или продукта за единицу времени [(моль/(лс)]. Поскольку каталитическая актив­ность не зависит от объема раствора, в котором протекает реакция, активность фермента выражают в каталах: 1 кат - это количество фермента, которое превращает 1 моль субстрата за 1 сек.

Другой единицей активности является международная единица (ME) - такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции (рН и температура среды, концентрация субстрата, отсутствие активаторов и ингиби­торов).

Удельной активность фермента (уд. ак.) пользуются при оценке количества молекул фермента среди других белков данной ткани, она численно равна коли­честву единиц активности фермента в образце ткани, деленному на массу белка в этой ткани:

Уд.Ак.=Количество превращенного субстрата(моль)/время(мин)хмасса белка(г)