Существующие методы микробиологической оценки поверхностей не позволяют собирать все микроорганизмы. Тем не менее, их использование напищевыхпредприятиях может обеспечивать ценную информацию.Очевидно, что в пробах не могут быть представлены все микроорганизмы.
Например, для исследования микроорганизмов, имеющихся на поверхности мяса, обожженное предметное стеклоприжимают к мясу, чтобы получить отпечаток с поверхностных слоев. Готовые отпечатки, полученные с поверхностных слоев, фиксируют над пламенем спиртовки и окрашивают по Граму. Готовые препараты рассматриваютпод микроскопом с иммерсией, подсчитывая количество бактерий в полезрения, и записывают их форму. Исследуют не менее 10 полей зрения. Подсчитывают отдельно грамположительные и грамотрицательные клетки и определяют среднее количество клеток.
Смывы. Смывы берут стерильными увлажненными ватно-марлевыми тампонами размером 5 - 7 куб. см, удерживаемыми стерильным пинцетом, или ватными, марлевыми тампонами, закрепленными на стержне из проволоки или дерева.
Тампоны стерилизуют завернутыми в бумагу. В случае закрепления тампона на металлической или деревянной палочке, пропущенной через ватную пробку, его вставляют в пробирку с 10 куб. см смывной жидкости (водопроводная вода, физраствор, пептонная вода) или с 10 куб. см жидкой питательной среды для обнаружения БГКП (среда Кода, Кесслер, Хейфеца и др.). Тампон не должен касаться жидкости. Все вместе стерилизуют при (121 +/- 1) °Св течение 30 мин.
Непосредственно перед взятием смыва тампон не палочке увлажняют наклонением пробирки или опусканием тампона вниз. Тампоны без палочки, находящиеся в стерильной чашке Петри, увлажняют стерильной смывной жидкостью из расчета 10 мл на 1 тампон. Смывы крупного оборудования и инвентаря берут с поверхности 100 кв. см. При взятии смывов с ровной поверхности используют металлические рамки-трафареты, ограничивающие площадь 100 кв. см. Перед каждым употреблением трафарет обжигают.
После взятия смыва тампон без палочки погружают либо в пробирку со средой для БГКП, либо в пробирку со смывной жидкостью, используемую в дальнейшем для посевов на питательные среды.
Смывы с мелких объектов (поверхность которых менее 100 кв. см) берут со всей поверхности.
После взятия смыва пробку с тампоном на палочке вновь вставляют в пробирку так, чтобы тампон погрузился в смывную жидкость или жидкую питательную среду для БГКП. Посевы термостатируют при (37 +/- 1) °Св течение 18 - 24 ч. В случае помещения тампона в смывную жидкость она является после тщательного перемешивания исходным материалом для посева.
При определении ОМЧ из смывной жидкости готовят разведения 10 и 10
и по 1 куб. см из приготовленных разведений проводят посев в чашки Петри с
заливкой мясопептонным агаром или средой, приготовленной из сухого
питательного агара, и термостатируют при (30 + /- 1) °С в течение 48 ч.
Оставшееся количество смывной жидкости по 1 куб. см или тампон засевают в 10 куб. см жидкой питательной среды для БГКП и термостатируют, как указано выше.
Допускается контроль на наличие БГКП производить с помощью индикаторных бумажек.
При анализе чистоты рук работников, которые непосредственно соприкасаются с чистым оборудованием или продукцией, смоченным тампоном тщательно обтирают обе ладони и пальцы. Исследования смывов проводят не реже двух раз в месяц. Контроль за обработкой рук проводится перед работой, после туалета, при переходе с одного участка на другой.
Для сбора материала смыва с одной поверхности изготавливают стерильные трафареты с отверстиями, конкретного размера, которые обрабатывают тампоном, например, 1 дм2 или 1 см2.
После наложения стерильного шаблона поверхность, выступаюшую в отверстии шаблона протирают тампоном.Использованный тампон опускают в его держатель (пробирку). Растворитель должен содержать нейтрализатордезинфектанта, если необходимо.
Микроорганизмы подсчитывают методом «стандартный подсчет колоний».
Посев отпечатком. Метод прямого посева микроорганизмов отпечатком на агаре предполагает использование чашек Петри. Их заполняют 15-16 мл плотной среды, которая после затвердевания создает агаровую пластинку.Чашки опрокидывают, соприкасаясь с объектом исследования, агаровая плотная среда соприкасается с исследуемой поверхностью.После термостатирования засеянной таким образом чашки Петри в ней подсчитывают число колоний.
В опыте с исследованием поверхности металла, обсемененного спорами Bacillussubtilis, споры были обнаружены в более чем 40% методом отпечатков, а методом смыва – в 50% случаев.
Методы «агаровых колбасок». Этот метод предполагает использование модифицированного шприца для инъекций.У100 мл шприцаотрезают вместе с канюлей дно и получают полый цилиндр, который заполняютагаром. Поршнем выдвигают столбик агара до конца цилиндра и прикасаются к исследуемой поверхности.Сверну столбик агараотрезают и помещают в чашку Петри,термостатируют и подсчитывают число колоний. Методику применяют для анализа микробиоты на поверхности мяса и растений. Так как скопления микроорганизмов образуют одну колонию, полученное количество микроорганизмов методом «агаровых колбасок» меньше, чем – методами с использованием пробоподготовки, которые позволяют дезинтегрировать скопления бактерий.
Другие поверхностные методы. Липкая пленка. Липкую пленку приклеивают к исследуемой поверхности, затем контактировавшей стороной накладывают на агаровую пластнку. Метод менее эффективен, чем смывы, но с успехом используется в оценке количества микроорганизмов на поверхности мяса.
Глава 6
Идентификация микроорганизмов являются целью определения принадлежности отдельных их популяций к тем или иным видам, родам семействам и т.д. Процесс идентификации организмов является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения биологических исследований.
Методы идентификации различных микроорганизмов разрабатывались и совершенствовались микробиологами и бактериологами на протяжении многих лет, и сегодня эти методы активно используются в науке, медицине, фармацевтике и даже в промышленном производстве (в том числе и продуктов питания).
Разработанные ранее методы представляют собой основу для исследователей и являются базисом для большого количества методик, которые позволяют определять такие свойства бактерий, как:
- морфологические (особенности и индивидуальные свойства строения клеток);
- культуральные свойства (питание, дыхание, условия для роста бактериальной культуры);
- ферментативные (биохимические свойства, связанные со способностью бактериальной культуры расщеплять сахара, белки, разрушать эритроциты);
- антигенные (свойства, связанные с особенностями антигенов чистой бактериальной культуры).
Идентификация любых бактерий с использованием метода посева на питательные среды невозможна без выделения чистой культуры. Это требование в микробиологии связано с тем, что присутствие микробов других родов и семейств во время проведения бактериологических исследований всегда существенно искажает результаты, вследствие чего исследователь производит неверные заключения.
Проблема получения чистой культуры и объективной идентификации микроорганизмов была и остается актуальной для микробиологии, микологии и вирусологии. Разработанные методы идентификации микроорганизмов делят на рутинные и современные. Предпочтение отдается методам идентификации, которые выполняются за относительно короткий срок (часы) и отличаются высокой степенью объективностью и точностью.
Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе дает возможность построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов.
Рутинные методы основаны на получение чистой культуры, изучении разнообразных ее свойств: морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и биологических. При этом затрачивается не только множество компонентов реакций и питательных сред, но и, что очень важно при санитарно-микробиологической оценке пищевых продуктов, – времени.
При идентификации микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумерической таксономии. Она основана на идеесчитать равноценными различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отношения числа положительных признаков к общему числу изученных. Путем количественной оценки возможно большего числа (обычно не менее ста) фенотипических признаков, которые подбирают так, чтобы их варианты были альтернативными и могли обозначаться знаками «минус» или «плюс»определяетсясходство между двумя исследуемыми организмами. Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента сходства.
Значение коэффициента сходства может меняться от 0 до 1. Коэффициент 1 означает полную идентичность, а 0 - полное несходство. Оценки комбинаций признаков производят с помощью компьютера. Полученные результаты представляют в виде матрицы сходства и /или в виде дендрограммы. Нумерическая таксономия может применяться при оценке сходства между таксонами микроорганизмов только невысокого ранга (роды, виды). Она не позволяет делать непосредственные выводы относительно генетического родства микроорганизмов, однако в известной степени отражает их филогенетические свойства. Так, установлено, что фенотипические признаки бактерий, поддающиеся изучению в настоящее время, отражают от 5 до 20% свойств их генотипа.
Современные методы идентификации не требуют многочисленного квалифицированного персонала и большого количества времени. Некоторые из них не требуют получения чистых культур. Они, в свою очередь, делятся на ручные и автоматические.
