На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретических, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравитационных методов наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок движется в виде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая и т.д.), то эти данные с большой долей вероятности могут свидетельствовать об однородности исследуемого белка.
В основе иммунохимического метода контроля гомогенности исследуемого белка лежит реакция преципитации его с соответствующей антисывороткой, полученной от иммунизированных этим белком животных. Для строгого доказательства гомогенности белка требуется одновременное использование нескольких методов.
Не потерял своего значения и метод кристаллизации белков с использованием сульфата аммония, а также метод определения растворимости белка. Последний, предложенный еще Д. Нортропом, основан на правиле фаз Гиббса, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от количества вещества, находящегося в твердой фазе. Метод может быть выполнен сравнительно легко и быстро в микромасштабах. Обычно определяют растворимость увеличивающегося количества исследуемого белка при постоянном количестве растворителя.
Доказательства гомогенности белка
Цель анализа конечного продукта, полученного в результате очистки, заключается в том, чтобы выяснить, содержит ли он один или большее число белков, и обнаружить в нем примеси, даже если они присутствуют в очень малых количествах. Так гель-электрофорез позволяет выявить 1% примеси.
1. Электрофорез как в нативных, так и в денатурирующих условиях, является методом №1 для доказательства гомогенности белка.
2. Определение молекулярной массы с помощью масс-спектрометрии.
3. Метод изоэлектрофокусирования.
4. Ультрацентрифугирование используется при анализе липопротеинов или других, связанных с мембранами белков. В опытах по седиментации хорошо разделяются компоненты с различными коэффициентами седиментации. Небольшие количества примеси детектируются по отклонению экспериментальных данных от теоретической прямой зависимости между логарифмом концентрации и квадратом расстояния от седиментирующей частицы до оси вращения.
5. О гомогенности препарата можно судить по данным N-концевого анализа, при условии, что N-концевая аминокислота не заблокирована и нет примесных белков с идентичной N-концевой аминокислотой.
6. Аминокислотный состав может дать сведения о гетерогенности препарата, если точно известны количества двух или более аминокислот и молекулярная масса белка. Например, количества тирозина и триптофана можно определить спектрофотометрически. Если молярное содержание этих аминокислот нельзя выразить простым отношением (к примеру, оно составляет 5:6, а получают 5,2:6,5), то в препарате присутствует примесь.
7. Кристаллизация. Использование кристаллизации как критерия гомогенности не является однозначным. Выделение гомогенного белка завершено и можно приступить к его характеристике.
ВОПРОСЫ:
1. Назовите методы очистки белков.
2. Перечислите диапазон применимости каждого.
3. Назовите преимущества и недостатки имеющихся методов.
4. Опишите особенности абсорбционной хроматографии.
5. Опишите особенности афинной хроматографии.
6. Опишите принцип метода изоэлектрического фокусирования.
Доме́н белка́ — элемент третичной структуры белка, представляющий собой достаточно стабильную и независимую подструктуру белка, фолдинг которой проходит независимо от остальных частей. В состав домена обычно входит несколько элементов вторичной структуры. Сходные по структуре домены встречаются не только в родственных белках (например, в гемоглобинах разных животных), но и в совершенно разных белках.
Достаточно часто доменам присваивают отдельные названия, так как их присутствие непосредственно влияет на выполняемые белком биологической функции — к примеру, Ca2+-связывающий домен кальмодулина, гомеодомен, отвечающий за связывание с ДНК в различных факторах транскрипции и др. Так как домены достаточно «автономны» в формировании своей структуры и выполнении своей функции, с помощью генной инженерии можно «пришить» к одному из белков домен, принадлежащий другому (создав таким образом белок-химеру). Такая химера при удаче будет совмещать функции обоих белков.
Так, например, путем слияния ДНК-связывающего домена Cas9 c различными регуляторными доменами удалось получить искусственные факторы транскрипции (crisprTF), избирательно направляемые на нужные участки генома с помощью изготовленных на заказ «РНК-гидов»[1][2][3]. С помощью Cas9-домена можно также сконструировать искусственные эндонуклеазы рестрикции, репрессоры, ферменты, модифицирующие эпигеном, такие как ДНК-метилазы и деметилазы.
Осмотическое давление а растворах собственно коллоидов и полимеров, как и в истинных растворах, Пропорционально их концентрации. Однако в связи с малой весовой концентрацией (менее 1,0%) коллоидов количество частиц в растворе настолько мало, что осмотическое давление в растворах собственно коллоидов очень низкое. Осмотическое давление в растворах белков и других высокомолекулярных соединении, концентрация которых достигает 10—12% и более, значительнее и оказывает существенное влияние на ряд Процессов в организме. Часть осмотического давления крови, обусловленная высокомолекулярными соединениями, в основном белками, называется онкотическим давлением. Оно невелико, составляя в норме всего около 0,04 атм., и. тем не менее, играет определенную роль в биологических процессах. Общее осмотическое давление крови достигает 7,7-8,1 атм. Осмотическое давление в растворах высокомолекулярных веществ в значительной степени зависит от температуры и рН. Повышение температуры в растворах высокополимеров увеличивает осмотическое давление в большей мере, чем следует из теоретического расчета. Это зависит от повышения степени диссоциации ионогенных групп белков и от дезагрегации белков на микроглобулы. Дополнительная гидратация микроглобул уменьшает количество свободного растворителя, то соответствует увеличению концентрации частиц в растворе, а за счет этого осмотическое давление ВМВ аномально высокое. Как показал Михаэлис степень диссоциации ионогенных групп гидрофильных коллоидов (амфолитов) минимальна в изоэлектрической точке, т.е. число частиц (ионы+молекулы) наименьшее при этом значении рН, Следовательно, осмотическое давление коллоидов оказывается самым низким в изоэлсктрической точке и увеличивается при смешении рН в обе стороны от нее. С увеличением концентрации раствора оно возрастает. Рассчитывается по уравнению Галлера:
p=СRT +m2*B где:
B- коэффициент, зависящий от природы дисперсной фазы и не зависящий от молекулярной массы ВМВ;
С - весовая концентрация полимера;
К - универсальная газовая постоянная;
Т - абсолютная температура.
Биологическое значение онкотического давления.
Осмотическое давление в жидкостях организма (кровь, лимфа, межклеточная жидкость, спинномозговая жидкость и др.) выполняет важную физиологическую функцию, влияющую на распределение в тканях организма воды. солей и различных питательных веществ. Осмотическое давление указанных биологических жидкостей зависит главным образом от растворенных в них низкомолекулярных минеральных веществ, преимущественно хлористого натрия, но также от высокомолекулярных соединений, находящихся в коллоидном состоянии. главным образом белков.
Несмотря на то, что в плазме крови содержится от 6 до 8% белков, онкотическое давление составляет примерно 0.5% (30-40 см водного столба) от общего осмотического давления плазмы, пр1гчем около 80% этого давления обусловлено наиболее низкодисперсными белками - альбуминами, а остальные 20% падают на другие белки плазмы. Существенным физиологическим моментом, связанным с важнейшими процессами, происходящими в организме является поддержание состояния осмотического равновесия между кровью и тканевыми жидкостями которое, будучи динамическим, обеспечивает постоянный обмен жидкости низкомокулярных питательных вещестд и конечных продуктов обмена. Одна из основных причин движения, жидкости обусловлена ультрафильтрациоными свойствами стенки капилляров проницаемой для воды и солей, но не для белков. В свяи со сказанным по одну сторону капиллярной стенки будет находиться плазма крови, богатая белками, а по другую - тканевая жидкость, имеющая меньшую концентрацию белков, в связи с чем возникают условия, необходимые для осмотического проникновения из тканей жидкости в плазму крови, т.е. к месту большей концентрации белков. Таким образом, распределение воды и минеральных веществ между кровью и тканями и поддержание осмотического равновесия обеспечивается в основном нормальной концентрацией белков в плазме крови, а кровяное давление компенсируется онкотическим давлением. Большое биологическое значение имеет соотношение между гидростатическим и онкотическим давлением в капилляре. Кровяное давление в области капилляров в среднем составляет 15 см. вод. ст., которое постепенно падает от 45 до 14 по направлению от артериальной части капилляров в области границ его стенок с плазмой крови к венозному участку капиллярной сетки. Безбелковая часть плазмы в результате гидростатического давления проникает в межклеточное пространство ткани, а в венозной части капилляров происходит обратный ток жидкости в сторону пониженного гидростатического давления по сравнению с онкотическим давлением крови. Аналогичные процессы имеют место и в почках при образовании мочи. При нарушении осмотического равновесия и изменении гидростатического и онкотического давления могут возникнуть различные формы патологии. При понижении содержания белка в крови, т.е. при гипопротеннемиях, вследствие голодания, нарушений деятельности пищеварительного тракта или потери белка с мочой при заболеваниях почек, возникает разница в онкотическом давлении в тканевых жидкостях и в крови. Вода устремляется в сторону более высокого давления в ткани возникают так называемые онкотические отеки подкожной клетчатки («голодные» и «почечные» отеки). Введение больших количеств NaCI, депонирующегося в подкожной клетчатке и также являющегося осмотически активным веществом, может серьезно ухудшить состояние больного. В оценке состояния и в лечении таких больных учет осмоонкотических явлений имеет очень важное значение.
