Особенности организации биотехнологического получения лекарственных веществ на основе растительных культур.

Известно, что корни растения воробейника краснокорневищного (Lithospermum erytrorhizion) содержат шиконин и его производные. Это растение издавна используется в Японии как лекарственное, т.к. оно обладает антибактериальной, противодизентерийной и гонадотропной активностью.

Шиконин – производное нафтохинона, вещество ярко-красного цвета, применяется также в качестве красителя. Для того чтобы концентрация шиконина в корнях достигла 1 – 2 %, возраст растения должен составлять 5 – 7 лет, а так как выращивать данное растение в промышленном масштабе в Японии не представляется возможным, его приходится ввозить из Кореи и Китая, и, следовательно, стоимость чистого природного вещества чрезвычайно увеличивается.

Поэтому весьма заманчивым является биотехнологическое получение шиконина на основе культуры тканей растений. Клетки растений не выделяют синтезируемые ими вторичные метаболиты в окружающую среду, а запасают их в вакуолях и органеллах, что затрудняет их выделение, однако накопление шиконина связано с достаточно простым отбором наиболее продуктивных линий, т.к. клетки, содержащие этот краситель имеют ярко-красную окраску. Удалось выделить линию, накапливающую до 15 % шиконина. Последующая оптимизация среды культивирования позволила достичь тринадцатикратного увеличения продуктивности культуры тканей.

В первых работах этой серии в результате изучения факторов питания было обнаружено, что увеличение количества сахарозы и уменьшение концентрации азота в питательной среде стимулирует производство нафтохиноновых пигментов. Добавление стрептомицина, аскорбиновой кислоты или фенилаланина к культурам способствовало биосинтезу производных шиконина, в то время как ионы кальция и железа ингибировали этот процесс. Позднее было показано, что производные шиконина продуцировались суспензионной культурой только при исключении из среды аммония. Аммоний, жизненно необходимый агент для клеточного роста, ингибировал биосинтез шиконина в суспензионной культуре.

Итак, с целью увеличения выхода был разработан двухступенчатый процесс культивирования, при котором на первой стадии создавались оптимальные условия для наращивания биомассы, а на втором – для образования вторичных продуктов. Клетки растят в суспензионной культуре: для этого процесса лучше всего подходят эрлифтные ферментеры, в которых осуществляется одновременно как интенсивное перемешивание, так и разделение клеток, и, кроме того, преимуществом данных аппаратов является то, что вероятность повреждения относительно хрупких клеток минимальна. Процесс производства шиконина начинается с наращивания клеток в ферментере объемом 200 л, содержимое которого затем переносят в биреактор объемом 750 л, затем проводят экстракцию обычными методами. Выход продукта за один цикл составляет 5 кг, поэтому стоимость целевого продукта значительно снижается, чем при получении его вышеупомянутым способом.

В настоящее время в России уже несколько заводов Министерства медицинской и микробиологической промышленности освоили производство биомассы корня женьшеня по технологии, разработанной под руководством Инессы Васильевны Александровой (ВНИИ биотехнология).

Шиконин можно выделять и иным способом – путем изменения рН среды или путем добавления веществ, влияющих на проницаемость растительной клетки, например диметилсульфоксида. Реализация такого подхода целесообразна при работе с иммобилизованными клетками, т.к. в данном случае благодаря селективной проницаемости можно будет постоянно удалять вторичные метаболиты из внутриклеточных вакуолей без глубокого нарушения первичного обмена веществ

Иммобилизация, осуществленная мягким (щадящим) способом, может способствовать внутриклеточному накоплению соединения в ответ на создание микроокружения, имитирующего условия, «царящие» в продуктивных частях растений.

Направление питательных веществ не на рост, а на образование вторичных продуктов также является одним из способов повышения выхода целевого продукта.

Так, например, клетки растения Catharanthus, иммобилизованные в альгинат-акриламидной матрице, в больших количествах выделяют в среду аймалин и серпентин

Для получения ряда алкалоидов, производных индола (аймалина, винбластина и т.п.) можно использовать барвинок Catharanthus roseus. Концентрация этих алкалоидов очень мала, поэтому их приходиться выделять из смеси других алкалоидов, свойственных растениям

В культурах тканей винбластин и винкристин не образуются и, поэтому был разработан альтернативный способ их производства. Эти алкалоиды представляют собой асимметричные димеры катарактина и виндилина, причем катарантин можно получать путем культивирования растительных клеток и тканей в достаточно большом количестве с относительно небольшой примесью других алкалоидов, а интересующие нас димеры затем можно получить в результате химического воздействия на исходные соединения.

Основы биотрансформации дигитоксина.

Основным сырьем для промышленного получения сердечных гликозидов являются виды Digitalis. Биосинтез дигитоксина наблюдался при органогенезе в культуре ткани. Большой интерес представляют исследования, посвященные биотрансформации сердечных гликозидов различными клеточными культурами. Свойство культур тканей превращать (трансформировать) соединения, добавленные в питательную среду, в ценные фармакологически активные вещества, обусловлено значительным биохимическим потенциалом клеток, высокой активностью ферментных систем.

Изучение биотрансформации малоиспользуемого в терапии гликозида дигитоксина в ценные гликозиды проводилось на клеточных линиях Digitalis. Высокий выход продуктов был достигнут при селекции специализированных линий и оптимизации условий роста в специальных аппаратах.

Высокоэффективный двухстадийный процесс биотрансформации дигитоксина был разработан для клеток Digitalis lanata. После 10-ти дневной инкубации клеток Digitalis lanata в «ростовой» питательной среде культуру переносили в «продукционную» среду (8 %-ный раствор глюкозы) с субстратом для биотрансформации – дигитоксином. В этих условиях весь дигитоксин в течение 2 дней трансформировался в деацетиллантозид С (88 %) и пурпургликозид А (12 %).

В литературе имеются сведения о биотрансформации дигитоксигенина культурами тканей Strophantus gratus, S. Amboensis, S. Intermedius, дигитоксина – клетками D. Purpurea, прегненолона и прогестерона – N. tabacum и Sophora angustifolia и др. Подробно была изучена способность к биотрансформации дигитоксигенина суспензионной культурой S. Intermedius, выделены и идентифицированы продукты превращений – 3-эпидигитоксигенин, 3-эпи-17-ан-дигитоксигенин, периплогенин, гитоксигенин, 3-эпигитоксигенин, 3-эпипериплогенин, дигитоксигенина -b-D-глюкозид.

Эти результаты свидетельствуют о том, что реакции окисления и эпимеризации 3b-гидроксила, 5b-гидроксилирования и глюкозилирования являются характерными, общими для многих культур. В то же время реакции1b-, 4b-, 12b- и 16b-гидроксилирования и изомеризации 17b-лактонного кольца, вероятно, зависят от происхождения ткани и условий трансформации.

В настоящее время разработаны промышленные способы получения ценных карденолидов, основанные на иммобилизации растительных клеток Digitalis в специальных биокатализаторах.

1. Основы слияния растительных клеток.

Как уже отмечалось выше, основой клеточной инженерии является гибридизация соматических клеток, т.е. слияние неполовых клеток с образованием единого целого. Слияние клеток может быть полным или клетка-реципиент может приобрести отдельные части клетки-донора: цитоплазму, митохондрии, хлороплсты, ядерный геном или его крупные блоки. Введение небольших блоков генетической информации обычно осуществляется методами генетической инженерии. Природа допускает лишь строго определенное сочетание родительских форм.