Общая характеристика каротиноидов.

Занятие 12.

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Каротиноиды. Схема биосинтеза. Стимуляторы каротинообразования. Получение витамина А на основе b-каротина. Определение суммарного количества каротиноидов в культуре микроорганизма.

 

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Рассмотрение особенностей биотехнологического получения каротиноидов, образования витамина А из β-каротина, особенностей биосинтеза убихинонов.

 

Вопросы, выносимые на семинар:

1. Введите понятие «каротиноиды». Приведите характеристику данного класса соединений.

2. Введите понятие «каротин». Приведите классификацию каротинов. Охарактеризуйте биологическую роль каротинов. Поясните особенности определения суммарного содержания каротинов.

3. Охарактеризуйте понятие «ксантофиллы». Охарактеризуйте основные функции ксантофиллов.

4. Поясните особенности микробиологического получения каротиноидов: продуценты, питательные среды, условия культивирования, аппаратурное оформление процесса.

5. Охарактеризуйте значение культуры растительных клеток и тканей в области получения каротиноидов.

6. Приведите характеристику витамина А.

7. Приведите характеристику убихинонов: понятие, свойства, биологическая роль. Поясните особенности биосинтеза убихинонов на основе применения культуры растительных клеток и тканей.

 

Задание 1: Изучить учебный материал.

 

Учебный материал.

Общая характеристика каротиноидов.

 

Каротиноиды – это желтые, оранжевые, красные или коричневые пигменты, которые сильно поглощают в сине-фиолетовой области. Обычно они «замаскированы» зелеными хлорофиллами, но хорошо выявляются перед листопадом, т.к. хлорофиллы в листьях распадаются первыми. Каротиноиды содержаться также в хромопластах некоторых цветов и плодов, яркая окраска которых служит для привлечения насекомых, птиц и других животных, участвующих в опылении цветов или распространении семян

Каротиноиды относятся к тетратерпенам. Каротиноиды имеют в своей структуре изопреновую цепь, состоящую из четырех бутадиеновых остатков, разделенных в середине СН=СН – группой, и одного или двух циклогексеновых b-иононовых кольца на концах цепи.

Каротиноиды синтезируются многими пигментными микроорганизмами из рода Aleuria, Blakeslea, Corynebacterium, Flexibacter, Fusarium, Halobacterium, Phycomyces, Pseudomonas, Rhodotorula, Sarcina, Sporobolomyces, а также синтезируются высшими растениями, грибами, бактериями, тогда как животные их не образуют. Всего в настоящее время описано около 500 каротиноидов.

Каротиноиды подразделяются на каротины – ненасыщенные углеводороды и ксантофиллы – кислородсодержащие каротиноиды, имеющие гидрокси-, метокси-, карбокси-, кето- и эпоксигруппы.

a-, b-, g-каротины широко распространены в растениях, ликопин, зеаксантин, виолаксантин, флавоксантин и др. В значительных количествах каротиноиды накапливаются в корнеплодах моркови, плодах шиповника, рябины обыкновенной, смородины, облепихи, томатов, абрикоса, тыквы, цветах календулы, листьях шпината, салата, крапивы.

Каротиноиды локализуются в виде сложных эфиров и гликозидов в клеточной мембране микроорганизмов, либо в свободном состоянии – в липидных гранулах в цитоплазме. Каратиноид «ретиналь», например, у галофильного вида – Halobacterium halobium – соединен с белком через остаток лизина (опсиноподобный белок); он участвует в синтезе АТФ благодаря генерации трансмембранного потенциала. В целом, основная функция каротиноидов – защитная. Их биосинтезу в клетках способствует свет.

Каротиноиды играют существенную роль в процессе фотосинтеза, участвуя в реакциях эпоксидации и образуя многочисленные кислородные производные. Они также участвуют в процессах дыхания и роста растений, переноса активного кислорода, фиксации света, стимулируют окислительно-восстановительные и генеративные процессы. В растениях они находятся в хромо- и хлоропластах в жирорастворимом состоянии или в виде водорастворимых белковых комплексов.

Каротиноиды имеют три максимума поглощения в сине-фиолетовой области спектра.

Они не только функционируют как дополнительные пигменты, но и защищают хлорофилл от избытка света и от окисления кислородом, выделяющегося при фотосинтезе.

 

Каротины.

Каротины – это углеводороды, большую часть которых составляют тетратерпены (С₄₀-соединения). Самым распространенным и самым важным среди них является β-каротин.

Каротин (от лат. сarota – морковь) – представитель семейства каротинов, относящийся к каротиноидам, т.е. биологически активным растительным пигментам желтого, оранжевого, красного цвета. Каротины относятся к жирорастворимым полиненасыщенным углеводородам терпенного ряда, являющимися продуктам полимеризации изопрена.

Каротин обладает биологической активностью провитамина А, участвует в защите клеток от разрушительного действия света, в процессе зрения и переносе энергии в процессе фотосинтеза. В организме каротин находится в свободном виде или в виде комплекса с белками – хромопротеинов.

b-каротин используется организмом человека для синтеза витамина А. Кроме того, он проявляет выраженным антиоксидантный эффект, способствует снижению риска развития онкологических и других заболеваний, возникающих в связи с повышенной экологической нагрузкой на человека; активизирует функции лейкоцитов и способствует тем самым профилактике инфекционных и простудных заболеваний, улучшает работу иммунной и репродуктивной систем организма. Оказывает хороший лечебный эффект при гастрите, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, способствует быстрому заживлению ран и выздоровлению после оперативных вмешательств.

1 мг β-каротина по эффективности эквивалентен 0,17 мг витамина А, т.е. эффективность β-каротина в 6 раз меньше, но вместе с тем β-каротин, как это уже отмечалось выше, обладает рядом специфических функций, имеющих важную роль в поддержание здоровья.

Центральной функцией каротинов в организме млекопитающих является его функция провитамина А, что обуславливается его превращением в витамин А (ретиналь). Все изомеры каротина – α-, β-, γ-каротины – обладают активностью провитамина А. В качестве провитамина А наиболее эффективен β-каротин, поскольку из него образуется две молекулы витамина А (из α- и γ-каротинов образуется всего лишь по одной молекуле витамина А). Активность витамина А измеряется Международными единицами (МЕ). Биологическая активность 1 МЕ витамина А эквивалентна биологической активности 0,6 мкг β-каротина. Данный изомер каротина широко распространен в растениях, животных, микроорганизмах. α-каротин часто сопутствует, β-каротину; так, например, в моркови содержится 85 % β-каротина и 15 % α-каротина.

Человек и животные не способны синтезировать каротины, однако они могут метаболизировать экзогенный каротин. В организм человека главным образом поступает каротин растительного происхождения.

Превращение каротинов в витамин А осуществляется в кишечнике под действием фермента диоксигеназы. Образующийся вначале альдегид ретиналь затем восстанавливается в ретинол в присутствии НАД·H или НАДФ·H. Усвоение каротина происходит при условии достаточного количества желчи, активной липазы и антиоксидантов (витамина Е, витамина С и др.), предохраняющих каротины от окисления.

Дети усваивают каротины хуже, чем взрослые.

В слизистой оболочке кишечника ретинол образует сложные эфиры с жирными длинноцепочечными кислотами; эти эфиры, адсорбируясь на хиломикронах, транспортируются по лимфатической системе в печень, которая является основным депо витамина А.

Многие ткани содержат эфиры ретинола с жирными кислотами. В плазме крови человека ретинол находится в комплексе со специфическим ретинол-связывающим белком, относящимся к α-глобулинам; концентрация этого белка в плазме крови составляет 4 – 5 мг/100 мл. Содержание каротина в плазме крови зависит от его поступления с пищей и составляет 80-320 мкг/100 мл, в плацентарной крови - 90 мкг/100 мл, в пуповинной крови – 90 мкг/100 мл. Концентрация каротина в грудном молоке ниже, чем в крови. В крови концентрация каротина резко снижается при родах (8-30 мкг/100 мл) и некоторых заболеваниях (спру, экземе и т.п.).

Повышение содержания каротина в плазме крови (выше 400 мкг/100 мл) в результате избыточного поступления каротина с пищей – каротинемия – приводит к окрашиванию плазмы крови и отдельных участков кожи в желто-оранжевый цвет. Депонирование каротинов в эпидермисе называют также псевдожелтухой, каротинозом, каротинодермией и т.д. Каротинемия отмечается при острых поражениях печени, сахарном диабете, и т.п.

 

Определение суммарного количества каротинов:

 

Специфического метода определения содержания каротинов в клинике не существует. Суммарно каротины и витамин А можно определить с помощью реакции Карра – Прайса: к растворенной в хлороформе пробе биологической жидкости добавляют 30 %-ный раствор треххлористой сурьмы в хлороформе, и по интенсивности образовавшейся синей окраски, прямо пропорциональной содержанию каротинов в растворе, определяют их концентрацию. Для реализации данного метода определения используют колориметрический метод.

Колориметрический (фотоколориметрический) метод анализа – совокупность методов качественного и количественного анализа по интенсивности инфракрасного, видимого и ультрафиолетового излучения. Разновидностью колориметрического метода анализа является спектрофотометрия, основанная на измерении оптической плотности веществ с помощью спектрофотометров, в которых источником излучения служат: лампа накаливания, водородная или дейтериевая лампа; монохроматором – призма или дифракционная решетка, что позволяет выделить достаточно узкие участки (1 – 20 нм) во всем интервале инфракрасного, видимого и ультрафиолетового спектра.

 

Ксантофиллы.

 

Ксантофиллы – природные пигменты из группы каротиноидов; кислородсодержащие производные каротинов. Известно более 50 различных ксантофиллов с различными функциональными группами (спирты, кетоны и др.), относящихся к ациклическим, моноциклическим, бициклическим каротиноидам. Содержатся в листьях, цветах, плодах и почках высших растений, а также во многих водорослях и микроорганизмах. В сочетании с флавоноидами создают осеннюю окраску листвы. Участвуют в фотосинтезе в качестве дополнительных пигментов. Возможно, что ксантофиллы играют роль светофильтров, защищающих чувствительные к свету ферменты от разрушения.

4. Биотехнологическое получение каротиноидов.

4.1 Микробиологический синтез каротиноидов.

 

Наиболее перспективными продуцентами для биосинтеза каротиноидов являются бактерии, дрожжи (чаще всего на практике применяют дрожжи рода Candida, которые хотя и синтезируют небольшое количество каротиноидов, но отличаются высокой скоростью роста и способностью хорошо утилизировать разнообразные источники сырья) и мицелиальные грибы. Более часто на практике применяют зигомицеты Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. Спаривающиеся (+) и (-) особи этих видов при совместном культивировании могут образовывать 3 – 4 г каротина на 1 л среды.

Питательные среды для развития микроорганизмов-продуцентов достаточно сложны по составу, они включают в себя источники углерода, азота, витаминов, микроэлементов, специальных стимуляторов (гидрол, кукурузно-соевая мука, растительные масла, керосин, b-ионон или изопреновые димеры и т.п.).

Вследствие того, что в клетках микроорганизмов образуются активные комплексы гидролитических ферментов, они способны утилизировать в качестве источников углерода различные субстраты – гидролизаты растительных отходов, мелассу, низкомолекулярные спирты и т.п. В качестве источника азота в питательную среду добавляют дрожжевой или кукурузный экстракт, соли аммония; при этом соотношение углерода к азоту должно составлять 320-400. Также кроме источников углерода и азота в питательную среду добавляют фосфор, калий, магний, цинк, железо, марганец, витамины группы В, токоферол.

Стимуляторы каротинообразования целесообразно вносить в культуральные среды в конце тропофазы, то есть когда продуцент переходит в продуктивную фазу (идиофазу).

Вначале штаммы микроорганизмов-продуцентов выращивают раздельно, а затем – совместно при 26 °С (т.к. при более высокой температуре уменьшается выход целевого продукта процесса и ухудшается его качество) и усиленной аэрации (т.к. для окисления углеродных субстратов необходим кислород) с последующим переносом в основной ферментер. Условия культивирования сохраняют прежними.

В процессе выращивания вначале наблюдается интенсивный рост микроорганизмов и незначительный синтез каротиноидов. Усиленный синтез каротиноидов отмечается в начале стационарной фазы развития микроорганизмов. Длительность ферментации – 6 – 7 дней.

По окончании стадии ферментации, каротиноиды извлекают ацетоном (или каким-либо другим полярным растворителем), переводят в неполярный растворитель. В случаях извлечения белково-каротиноидных комплексов, то применяют поверхностно-активные вещества в концентрации 1 – 2 %. В целях очистки и более тонкого разделения гомологов можно прибегнуть к методам хроматографии или к смене растворителей.

Витамин А₁ из b-каротина сравнительно легко можно получить путем гидролиза последнего.

В случае изготовления каротинсодержащей биомассы для скармливания животным и птицам возможно ее сочетанное применение с витамином А или без него.

В медицинских целях витамин А изготавливают в капсулах для приема через рот.

 

4.2. Значение культуры растительных тканей в процессе получения каротиноидов.

 

Основой биотехнологического использования культур тканей растений является способность клеток in vitro синтезировать самые разнообразные группы веществ: многочисленные фенольные соединения, гликозиды, эфирные масла, каротиноиды, смолы, алкалоиды и другие природные соединения. Все они участвуют в обмене веществ растений и выполняют определенные, часто весьма существенные, функции.

В последние годы число сообщений о синтезе вторичных метаболитов в культурах тканей значительно возросло.

Есть данные, свидетельствующие об образовании в культуре тканей каротиноидов. Так, например, в культуре ткани Solanum laciniatum обнаружены каротиноиды: b-каротин, криптоксантин, зеаксантин и лютеин, но в количестве в 1000 раз меньше, чем в органах целого растения. Такое низкое содержание каротиноидов характерно и для других культур. Отмечено стимулирующее влияние света на увеличение содержания каротиноидов в культуре ткани.

 

Витамин А.

Витамин А – это группа соединений, являющихся производными β-ионона.

Псевдоионон (2,6-диметилундекатриен-2,6,8-ОН-10) – вязкая жидкость, растворимая в спирте и не растворимая в воде. Получают данное соединение конденсацией цитрола с ацетоном в присутствии щелочи или взаимодействием дегидролиналиола с метилизопропениловым эфиром в присутствии кислотных катализаторов.

Основные функции витамина А заключаются в обеспечении роста, регуляции развития эпителиальных клеток, функционировании органов зрения (входит в состав зрительных пигментов родопсина и йодопсина).

Дефицит витамина А приводит к повышению вероятности простудных заболеваний, к ороговению кожных покровов, в наибольшей степени проявляющихся в области суставов, к снижению остроты вечернего зрения («куриная слепота»), к возникновению конъюктивита (ксерофтальмии). Витамин участвует в реализации сексуальной функции, способствуя выработке половых гормонов.

Содержится исключительно в продуктах животного происхождения. В организме может синтезироваться из провитаминов, относящихся к группе каротиноидов (например, b-каротин). Имеет способность накапливаться в клетках печени, поэтому ярко выраженный дефицит регистрируется у взрослого населения редко. Вместе с тем у жителей индустриально развитых стран проблема дефицита витамина А имеется, т.к. снижение потребления животных жиров с целью профилактики атеросклероза и формирования избыточной массы тела приводит к снижению поступления витамина А в организм. Кроме этого, отмечается низкий уровень содержания в рационе растительных масел – основного источника b-каротина. Для населения таких стран актуально дополнительное потребление витамина А и его предшественника b-каротина, в виде добавок к пище.

Избыток потребления синтетических препаратов витамина А может вызвать нежелательные токсические явления (рвоту, мелкоточечные кровоизлияния на коже, высокую температуру), которые проявляются наиболее ярко у детей.

 

6. Убихиноны.

Убихиноны представляют собой группу четырехзамещенных бензохинонов. Обозначается данный класс соединений, как KoQn, где n – число атомов углерода или изопреновых звеньев в боковой цепи молекул.

Убихиноны содержатся во всех организмах: у млекопитающих преобладает КоQ₁₀, у грибов – КоQ_8-10, у бактерий – КоQ_8-10.

Убихиноны легко восстанавливаются в убихинолы (1,4-диоксипроизводные).

В организме животных и человека синтезируются из фенилаланина и тирозина. Выделяют из природных источников или синтезируют путем конденсации 2-метил-5,6-диметокси-1,4-бензохинона с соответствующими полиизопреноидами.

Многочисленные данные свидетельствуют об участии убихинонов во внутриклеточном транспорте электронов, сопряженным с окислительным фосфорилированием. Предполагают, что в дыхательной цепи убихинон и цитохром реализуют два возможные пути потока электронов от флавопротеидов на цитохром С.

Соединения типа убихинонов, витаминов Е и К широко распространены в природе и участвуют в метаболических процессах как в форме 1,4-хинонов, так и в форме 6-оксихроманов. Механизм их действия в качестве переносчиков электронов до конца неясен. Предложен ряд гипотез, объясняющих превращение хинонов в процессе окислительного фосфорилирования, но не одна из них не получила достаточного экспериментального подтверждения.

До настоящего времени не установлены окончательно пути биосинтеза убихинонов и витаминов группы Е и К. Вероятно, в тканях растений и животных, а также микроорганизмов эти соединения и представители других классов, имеющие сходную структуру (например, сквален и каротиноиды), синтезируются из уксусной кислоты. В некоторых случаях (например, при биосинтезе токоферолов в растениях) предшественником ароматических колец является шикимовая кислота и родственные соединения.

 

6.1 Получение убихинонов с применением метода культуры ткани.

 

С 50-х гг. ткани табака Nicotina tabacum служит модельным объектом в исследованиях по физиологии и генетике растительной клетки. После детального фотохимического изучения она была предложена в качестве продуцента убихинона (кофермента), участвующего в клеточном дыхании. По своей химической структуре убихиноны являются n-бензохинонами, боковая цепь которых представлена 5 – 10 изопреновыми остатками. Активное изучение культуры ткани табака принадлежит японской фирме «Tobacco and Salt Public Corp.». Исследования фирмы реализованы в промышленном получении биомассы табака в качестве продуцента убихинона-10.

 

Задание 2: Идентификация витамина группы А, содержащегося в конкретной задаче с помощью качественных реакций по предложенной схеме.

 

а) Реакция с серной кислотой (реакция Друммонда).

Принцип реакции: В основе реакции лежит способность серной кислоты отнимать от ретинола воду с образованием цветных продуктов реакции.

Ход работы: В сухую пробирку помещают несколько капель рыбьего жира (источник витамина А) и 10 капель хлороформа. После растворения жира осторожно добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется темно-синее окрашивание, быстро переходящее в буро-красное.

 

б) Реакция с сульфатом железа.

Принцип реакции: В основе реакции лежит способность сульфата железа отнимать от ретинола воду с образованием цветных продуктов реакции.

Ход работы: К 2 каплям хлороформенного раствора ретинола добавляют 5 – 10 капель ледяной уксусной кислоты, насыщенной сульфатом железа и 1 – 2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное. Каротины дают при данной реакции зеленоватое окрашивание.

 

Литература:

 

1. Биологическая химия: Руководство к лабораторным занятиям/ Сост. Комов В.П., Шведова В.Н., Кириллова Н.В., Спасенкова О.М., Фирсова В.И., Троицкая Л.А. – СПб.: СПХФА. – 1998.

2. Биотехнология в 8-ми томах/ Под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М.: Высш.шк. – 1988.

3. Биотехнология: принципы и применения/ Под ред. Хиггинса И., Беста Д., Джонса Дж. – М.: Мир. – 1988.

4. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб.: ИФ Наук. – 1995.

Лекционный материал по биотехнологии.

5. Методические указания к практическим занятиям по биологической химии/ Под ред. Закревского В.И. – Волгоград: ВМА. – 1999.

6. Николаева Л.А. Культура тканей лекарственных растений и ее биотехнологическое использование: Текст лекций. – СПб.: СПХФИ. – 1992.

7. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды/ Пер. с англ. Мехедова С.Л., Миркина С.М. – М.: Мир. – 1987.

8. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб./ Под ред. В.С. Шевелухи. – М.: Высш. шк. – 1988. – 416 с.

9. Словарь по биотехнологии/ Симонян А.В., Покровская Ю.С. – Волгоград. – 2002.

 

Темы рефератов.

1. Механизмы регуляции процесса биосинтеза каротиноидов.

2. Перспективы промышленного биотехнологического производства витамина А.

3. Особенности биосинтеза убихинонов.

4. Перспективы получения каротиноидов на основе культуры растительных клеток и тканей.