РЕФЕРАТ
НА ТЕМУ:
«Виявлення та визначення генетично модифікованих ознак в харчових продуктах»
Виконала
студентка 1 курсу магістратури
групи ХАМАЛ
Грицик Наталія Олексіївна
Київ-2013
ЗМІСТ
| ВСТУП | |
| РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНІ ПОНЯТТЯ ПРО ГМО | |
| 1.1. Визначення, історія та передумови виникнення | |
| 1.2. Принципи отримання ГМО | |
| 1.2.1. Способи отримання ГМ мікроорганізмів | |
| 1.2.2. Отримання трансгенних рослин | |
| 1.2.3. Отримання трансгенних тварин | |
| РОЗДІЛ 2. ВИЯВЛЕННЯ ТА ВИЗНАЧЕННЯ ГЕНЕТИЧНО МОДИФІКОВАНИХ МАТЕРІАЛІВ У ХАРЧОВІЙ ПРОДУКЦІЇ | |
| 2.1. Загальна характеристика методів аналізу ГМО | |
| 2.2. Методи аналізу фенотипу | |
| 2.3. Методи визначення специфічних білків, синтезованих трансформованими рослинами (імунодіагностика) | |
| 2.4. Методи аналізу ДНК. | |
| 2.5. Real-time ПЛР | |
| 2.6. Інші методи аналізу рослинного матеріалу на наявність генетичних модифікацій. | |
| 2.6.1. ВЕРХ та ІЧ-спектроскопія | |
| 2.6.2. Біоаналізатор Agilent 2100 | |
| 2.6.3. Метод ДНК-чіпів (DNA microarrays) | |
| 2.6.4. Поверхневий плазмон ний резонанс | |
| 2.6.5. Сканометричний аналіз ДНК | |
| 2.7. Деякі методичні проблеми | |
| ВИСНОВКИ | |
| СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ |
ВСТУП
«Генна революція» відкрила нову еру в розвитку суспільно-економічних відносин. Під її впливом формуються нові ринки товарів і послуг, змінюється їх вартість та способи виробництва, виникають нові і можуть зникати деякі традиційні види діяльності, змінюється структура і напрям інвестиційних потоків. Вже сьогодні широке використання методів сучасної біотехнології спричинило значні зміни в сільському господарстві, промисловому виробництві, енергетиці, медицині та ветеринарії. Ці процеси стрімко розвиваються і вже мають значний вплив на міжнародну торгівлю, яка буде тільки збільшуватися, що призведе в майбутньому до зміни структури світового господарства і національних економік багатьох країн.
Сьогодні очевидно, що сучасні біотехнології відкривають перед людством великі перспективи і несуть з собою як переваги, так і можливі невідомі ризики і загрози. Їх використання у багатьох сферах викликає сьогодні великий резонанс у суспільстві, але найбільша увага прикута до генетично модифікованих організмів. Наскільки використання ГМО перспективне і безпечне - на це питання сьогодні намагаються дати відповідь вчені, експерти міжнародних та громадських організацій.
Але суспільство бентежить не так генетичне модифікування як специфічна технологія, скільки контекст, в якому відбувається розробка ГМО, тому що досить часто методи генної інженерії сприймаються як «втручання у справу Божу». Застережливе ставлення до ГМО пов'язано не тільки з громадськими та політичними цінностями, юридичними та релігійними нормами, а також з питаннями здоров'я нації, економічної безпеки держави та екологічної ситуації на планеті.
ГМО все частіше стали входити в продукти харчування. В даний час вміст ГМО в продуктах є звичним і прийнятним. Варто байдуже ставитися до проблеми ГМ-організмів? Більшість вчених вважає, що потрібно все ж враховувати можливі ризики від ГМО, вводити мораторій на комерційне використання, так як ця продукція може завдати незворотної шкоди біологічному різноманіттю екосистем, здоров'ю людей і тварин. Крім цього зростає розрив між країнами Західної та Східної Європи у рівнях поінформованості про потенційний ризик випуску ГМО.
РОЗДІЛ 1. ЗАГАЛЬНІ ПОНЯТТЯ ПРО ГМО
Визначення, історія та передумови виникнення
Продовольча проблема є однією з найважливіших проблем людства. Особливо гостро вона стоїть в країнах, що розвиваються, де відбувається стрімке зростання населення до 100 млн. осіб на рік, і дуже слабко розвинене сільське господарство. Постійні поставки гуманітарної допомоги з боку розвинених країн і міжнародних організацій є явно недостатніми для боротьби з голодом. Вже зараз дефіцит харчових продуктів у світі перевищує 60 млн. тонн, а число людей, які страждають від недостатнього харчування, наближається до 1 млрд. чоловік. Таким чином, сучасна стратегія виробництва харчових продуктів повинна бути спрямована на пошук виходу із продовольчої кризи в найкоротші терміни. Виникла необхідність у застосуванні принципово нових підходів до створення високопродуктивних агросистем, що забезпечують значне підвищення врожайності сільськогосподарських культур і продуктивності худоби.
Вихід було знайдено в особі трансгенних організмів [1].
Під ГМО розуміють живі організми, що мають навмисно змінені послідовності нуклеїнових кислот. Зазначені зміни можуть зводитися до введення або видалення генетичних фрагментів. При цьому може вводитися як чужорідна нуклеїнова кислота (наприклад, бактерії, що містять ген інсуліну людини), так і нуклеїнова кислота даного виду (наприклад, для підвищення вмісту крохмалю в картоплі гени, пов'язані з синтезом крохмалю, можуть бути «продубльовані» кілька разів). ГМО об'єднують три групи організмів - генетично модифіковані мікроорганізми (ГММ), тварини (ГМТ) та рослини (ГМР).
Сучасні біотехнології (створення ГМО) залежно від призначення поділяються на чотири типи:
• червоні біотехнології - використання ГМО в якості фабрики для виробництва лікарських препаратів;
• зелені біотехнології - використання ГМ-рослин у сільському господарстві та лісівництві;
• білі біотехнології - використання ГМО в різних галузях промисловості;
• існує також термін «блакитні біотехнології», він, як правило, застосовується до модифікацій у водних екосистемах [3].
Перший ГМ-продукт був отриманий в 1972 році, коли вчений Стенфордського університету Пол Берг об'єднав у єдине ціле два гени, виділених з різних організмів, і отримав гібрид, який не зустрічається в природі. Так був винайдений модифікований тютюн. Всього через кілька років у США почала розвиватися індустрія створення генетично модифікованих організмів (ГМО). Дуже скоро вчені зрозуміли, завдяки генній модифікації рослини і овочі стають морозостійкість, довше зберігаються і їх не їдять комахи [2].
Перший ГМ мікроорганізм - кишкова паличка з людським геном, що кодує синтез інсуліну, з'явився на світ в 1973 році. У зв'язку з непередбачуваністю результатів учені Стенлі Коен і Герберт Бойєр, які зробили цей винахід, звернулися до світового наукового співтовариства із закликом призупинити дослідження, написавши листа до журналу Science; в числі інших під ним підписався і сам Пол Берг. У лютому 1975 року на конференції в Асіломарі (Каліфорнія) провідні фахівці в галузі генної інженерії вирішили перервати мораторій і продовжити дослідження з дотриманням спеціально розроблених правил. На відпрацювання методики промислового виробництва мікробно-людського інсуліну та його перевірку з особливою пристрастю знадобилося сім років: тільки в 1980 році американська компанія Genentech почала продаж нового препарату [1].
У 1994 році американська компанія Monsanto (сумно відома як винахідник речовини Agent Orange, що застосовувався для «випалювання» рослин під час війни США у В'єтнамі, в результаті чого понад мільйон в'єтнамців стали інвалідами, тисячі солдатів армії США померли від раку) представила свою першу розробку генної інженерії - помідор під назвою FlavrSavr. Він міг у напівдозрілому стані місяцями зберігатися в прохолодному приміщенні, проте варто було плодам опинитися в теплі - вони тут же червоніли. Такі властивості модифіковані помідори отримали завдяки з'єднанню з генами камбали. Потім учені схрестили сою з генами деяких бактерій, і ця культура стала стійкою до гербіцидів, якими обробляють поля від шкідників [2].
Згодом у світі було виведено близько тисячі генномодифікованих культур, однак з них тільки 100 дозволені до промислового виробництва. Найбільш поширені - помідори, соя, кукурудза, рис, пшениця, арахіс, картопля.
За підсумками 2008 року, площа посівів ГМ-культур перевищила 114 200 000 гектар. Генномодифіковані культури вирощують близько 10 млн фермерів у 21 країнах світу. Лідером у виробництві ГМ-культур є США, слідом йдуть Аргентина, Бразилія, Китай та Індія. У Європі до геномодифікованих культур ставляться насторожено, а в Росії висаджувати ГМ-рослини зовсім заборонено, але в деяких регіонах ця заборона обходиться - посіви геномодифікованої пшениці є на Кубані, в Ставрополі і на Алтаї [3].
1.2. Принципи отримання ГМО
1.2.1. Способи отримання ГМ мікроорганізмів
Здатність організмів синтезувати ті чи інші біомолекули, в першу чергу білки, закодована в їх геномі. Тому досить «додати» потрібний ген, узятий з іншого організму, в бактерію, яка здатна рости в простих умовах і надзвичайно швидко розмножуватися. Але спроби провести перенесення в бактерії безпосередньо геномної ДНК привели до суперечливих результатів. Тільки в 70-і роки були отримані відтворювані результати із застосуванням так званої векторної трансформації. В основі цього підходу лежить використання векторних молекул - ДНК, здатних переносити в клітину гени, що містяться в них, де ці молекули реплікуються автономно або після інтеграції з геномом. Вирішальну роль у цих експериментах зіграли також методи отримання індивідуальних генів, накопичення їх у необхідній кількості шляхом клонування, тобто практично необмеженого розмноження в бактеріальних клітинах [3].
В основі всіх досягнень генетичної інженерії лежить одна з особливостей будови геному бактерій - наявність у них невеликих, відмінних від хромосоми, кільцевих молекул ДНК, званих плазмідами. Плазміди широко поширені в природі і зустрічаються у переважної кількості прокаріотів, а також у нижчих еукаріот - дріжджів. Важливою властивістю плазмід є їх здатність реплікуватися (розмножуватися) разом з ДНК клітини господаря. Клітини господаря не потребують плазмід для виживання в звичайних умовах, але часто плазміди надають їм ряд особливих властивостей. Плазміди надають бактеріям здатність до статевого розмноження (F-фактор), стійкість до антибіотиків і дезінфікуючих засобів (R-фактор), можливості засвоєння деяких складних органічних речовин, наприклад, вуглеводнів. Основна маса досліджень, які призвели до розвитку генної інженерії, проводилася на класичному об'єкті мікробіологів - кишковій паличці Escherichia coli. За допомогою спеціальних ферментів - ендонуклеаз рестрикції, або рестриктаз, плазміда, що несе який-небудь маркерний ген, наприклад, ген стійкості до певного антибіотика, розрізається в строго визначеному місці з утворенням з кожного боку декількох (від одного до п'яти) неспарених кінців - «липких кінців». За допомогою таких же рестриктаз отримують фрагмент генома організму-донора, що несе потрібний ген, наприклад, ген людського інсуліну. Останнім часом донорну ДНК частіше отримують шляхом «пришивання» «липких кінців» до молекули ДНК, отриманої шляхом зворотної транскрипції з матричної РНК потрібного гена (кДНК). Головну роль тут відіграє фермент зворотна транскриптаза, або ревертаза, вперше відкрита у ретровірусів (таких як ВІЛ і деяких збудниках злоякісних новоутворень - онковірусів). Далі за рахунок комплементарної взаємодії «липких кінців» відбувається включення потрібного гену в плазміду, при цьому утворюється нова рекомбінантна (гібридна) ДНК. Завершує процес фермент ДНК-лігаза, яка ковалентно зашиває розриви в ланцюгах ДНК. Наступний етап - перенесення рекомбінантної плазміди в бактерію. Такий процес - включення чужорідної ДНК в бактеріальну клітину носить назву трансформації, а молекула ДНК - вектор. Це явище зустрічається в природі, що говорить про те, що трансформація - це природний біологічний процес. У природних умовах трансформація зустрічається у таких бактерій, як збудник пневмонії [5].
Значно складніше піддати генетичної модифікації еукаріотичні мікроорганізми, а саме гриби. Як і у бактерій, у них є плазміди, але використання їх в якості векторів часто виявляється не дуже ефективним. Тому для того, щоб виник стабільний трансформант, необхідні дві послідовні події: проникнення рекомбінантної ДНК у клітину та її інтеграція в хромосомну ДНК. Такий метод називається інтегративна трансформація.
Далі генно-інженерне конструювання у дріжджів пішло по шляху створення кільцевих плазмід з центромерами, особливими ділянками ДНК, що забезпечують зв'язок з білками веретена розподілу і, отже, рівномірний розподіл таких плазмід між двома клітинами під час мітозу. Розвиток цього підходу призвело до створення цілих штучних міні-хромосом, що містять, крім центромерної ділянки, теломери на кінцях, загнуті у вигляді шпильки, і реплікатори - ділянки початку реплікації ДНК. Подібні мініхромосоми можуть включати відразу декілька корисних генів, що забезпечує виробництво потрібної біотехнологічної продукції.
1.2.2. Отримання трансгенних рослин
Вся робота з трансгенними рослинами спрямована на докорінну зміну методів традиційної селекції - бажані ознаки виходять завдяки введенню потрібних генів безпосередньо в рослину замість тривалої роботи зі схрещування різних ліній. Складність такого підходу полягає в тому, що на відміну від бактерій і дріжджів, рослини є багатоклітинними організмами. Для отримання продукту потрібний ген повинен знаходитися в кожній клітині організму, що досить складно здійснити. Але у рослин можлива повна регенерація in vitro з недиференційованих соматичних тканин з отриманням нормальних, здатних давати насіння, рослин. Ця властивість, що називається тотипотентністю, дає унікальну можливість отримати з одиничних клітин, генотип яких можна змінити аналогічно мікроорганізмам, цілу рослину з новими ознаками. Завдання залишилося за пошуком відповідного вектора для перенесення потрібного гена у виділені камбіальні клітини [3].
Дослідникам допомогла сама природа. Ще стародавнім грекам було відомо явище, зване корончата галлами. В уражених рослинах клітини корончата галлів набувають здатність необмежено розмножуватися, залишаючись недиференційованими. Такі клітини за своїми властивостями дуже схожі на ракові клітини тварин. Але тільки в XX столітті вченим вдалося встановити і вивчити причину виникнення такого явища. Винуватицею виявилася одна з ґрунтовних бактерій-Agrobacterium tumefaciens. Така бактерія, як і багато інших, містить плазміди. Одна з них, названа Ti-плазміда (від англійського скорочення «пухлину індукують»), і виявилася пухлинородним агентом для клітин зараженої рослини.
Ti-плазміда складається з декількох функціонально різних ділянок ДНК. Найбільш важливу роль відіграє ділянка Т-ДНК, що переноситься в клітину зараженої рослини і вбудовується в її хромосому. Там знаходяться гени синтезу фітогормонів і опінів. Фітогормони ауксини і цітікінін пригнічують диференціювання пухлинних рослинних клітин і переводять їх в стан поділу, а опінія використовується бактерією як джерело вуглецю, азоту та енергії. Іншими ділянками ДНК в Ti-плазміди є tra-область, де локалізовано гени, що контролюють кон'югацію бактерій, і ori-область, продукти якої забезпечують розмноження плазміди в бактеріальної клітці. Ще один важливий локус ДНК називається vir-область. Там містяться гени, відповідальні за перенесення Т-ДНК в рослинну клітину і вбудовування її в хромосому [5].
Найчастіше для створення трансгенних рослин використовують наступний підхід. Сегмент Т-ДНК вирізають з Ti-плазміди за допомогою рестриктаз і вбудовують в стандартну плазміду-вектор бактерії Escherichia coli. Рекомбінантна плазміда розмножується, і в ділянку Т-ДНК вставляють потрібний ген так само, як і в звичайну плазміду, з використанням рестриктаз. Такий молекулярний гібрид вводять в Agrobacterium tumefaciens, що містить незмінені Ti-плазміди. Завдяки процесу рекомбінації відбувається обмін гомологічними ділянками ДНК рекомбінантної і Ti-плазмід. В результаті вийде рекомбінантна Ti-плазміда, що несе потрібний ген. Роблять невелике пошкодження в рослинній тканині, виділяється сік з кислою реакцією і високою концентрацією лігніну. Це специфічно стимулює експресію генів vir-області. Лігнін взаємодіє з продуктом гена virA, передається сигнал всередину клітини, активується продукт гена virG, що в свою чергу активує інші гени вірулентності. Білок VirD2 в комплексі з білками VirC1 і VirD1 вносить одноланцюгові розриви в нуклеотидні послідовності правої і лівої меж Т-ДНК. Синтезується нова ланцюг Т-ДНК, а стара, з приєднаним до 5'-кінця VirD2, витісняється. Процес повторюється, і в клітині накопичується одноланцюжкова Т-ДНК, готова до перенесення. Потім комплекс Т-ДНК з білками VirD2 і VirE2 направлено переноситься в клітину рослини за допомогою процесу, схожого з бактеріальної кон'югацією. Перенесення відбувається через пили, а потім через канал в клітинній мембрані рослини, сформований білком VirE2. VirD2 і VirE2 сприяють проникненню Т-ДНК в геном рослини. Сайти інсерції випадкові. Процес триває близько 30 хвилин. Одиничні рослинні клітини заражаються, вирощується ціла рослина, всі клітини якої будуть експресувати потрібний ген [5].
Іноді виявляється простіше використовувати відразу дві рекомбінантні плазміди. Одна з них містить тільки vir-область і є плазмідою-помічницею. Друга плазміда повинна містити Т-ДНК з вбудованим потрібним геном. Плазміда-помічниця здатна переносити в рослинну хромосому не тільки свою Т-ДНК, якої у неї і немає, а й сусідню. Для полегшення відбору отриманих ГМ-рослин, рекомбінантна Ti-плазміда несе спеціальний маркерний ген. На відміну від мікроорганізмів, де в якості маркера використовується стійкість до антибіотиків, в рослинах використовують особливі білки, що володіють здатністю світитися в ультрафіолетовому світлі. Найбільш часто використовують гени люціферази світлячків і ген GFP медузи (по-англійськи, «зелений світиться білок») [5].
Крім технології, заснованої на використанні Ti-плазміди, останнім часом застосовуються і інші способи перенесення рекомбінантних ДНК в рослини. Сучасний арсенал методів трансформації дуже великий і включає такі підходи, як електропорація клітин (пропускання електричного розряду через суміш досліджуваних клітин і рекомбінантних плазмід, при цьому в мембранах клітин виникають проломи, і ДНК проникає в клітину і вбудовується в геном), струшування суміші клітин, ДНК і мікроголок (які проколюють мембрани аналогічно електричному струму), опосередкована вірусами інфекція, мікроін'єкції ДНК в клітини. Промислове застосування знайшла наступна технологія: за допомогою спеціального приладу «Shotgan» здійснюється обстріл рослинних тканин найдрібнішими кульками із золота або вольфраму, одягненими в молекули ДНК [4].
В окремих випадках виявляється необхідно не ввести який-небудь новий ген у рослину, а навпаки, заблокувати або послабити дію природного гена. Наприклад, в плоди томата, що містить білок PG, що додає плодам рихлість, вводять вектор, що містить перевернуту копію його гена. В результаті транскрипції утворюється антисмислова мРНК, яка комплементарно зв'язується з нормальною мРНК. Утворюється молекула двухланцюгової РНК, яка вже не може служити матрицею для синтезу білка. У результаті виходять тверді томати, вони довше зберігаються і більш стійкі до грибкових захворювань. Не менш перспективним є напрям з генної інженерії геному пластид і мітохондрій. У трансгенному матеріалі значно збільшується вміст продукту за рахунок більш активних метаболічних процесів. Ще безліч різних підходів, включаючи регуляцію активності генів, знаходяться на стадії розробки [3].
1.2.3. Отримання трансгенних тварин
Трансгенні тварини - експериментально отримані тварини, що містять у всіх клітинах свого організму додаткову інтегровану з хромосомами чужорідну ДНК, яка передається у спадок. Отримання трансгенних тварин здійснюється за допомогою перенесення клонованих генів у ядра зигот або ембріональних стовбурових клітин. Потім у репродуктивні органи реципієнта самки пересаджують модифіковані зиготи або яйцеклітини, у яких власне ядро замінено на модифіковане ядро ембріональних стовбурових клітин, або бластоцисти, що містять чужорідну ДНК ембріональних стовбурових клітин. Є окремі повідомлення про використання сперміїв для створення трансгенних тварин, проте цей прийом поки не отримав широкого розповсюдження [4].
В даний час для створення трансгенних тварин, крім мікроін'єкцій, використовуються інші експериментальні прийоми: інфікування клітин рекомбінантними вірусами, електропорація, «обстріл» клітин металевими частинками з нанесеними на їх поверхні рекомбінантними ДНК. Усі наявні методи переносу генів поки що не дуже ефективні. Для отримання однієї трансгенної тварини в середньому необхідні мікроін'єкції ДНК в 40 зигот мишей, 90 зигот кози, 100 зигот свині, 110 зигот вівці і в 1600 зигот корови.
Механізми інтеграції екзогенної ДНК або формування автономних репліконів при трансгенезі не відомі. Вбудовування трансгенів відбувається у випадкові ділянки хромосом, причому може відбуватися вбудовування як одиничної копії трансгену, так і безлічі копій, що розташовуються тандемно в одиничному локусі однієї з хромосом. Гомологія між сайтом інтеграції трансгени і самим трансгенних відсутня [4].
