Применение фенола и хлороформа при выделении ДНК способствует созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле.
Первый этап фенол-хлороформной экстракции РНК из крови подобен таковому при выделении ДНК. Метод выделения РНК на этапе непосредственного применения фенола с хлороформом отличается тем, что при рН=7-8 происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то время как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых условиях (рН<5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органической фазе.
Суммарную РНК впоследствии можно выделить осаждением с изопропиловым спиртом. Регулируя содержание фенола и его рН, можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе. На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы предотвратить вспенивание. LiCl используется для денатурации РНК, при этом эффективно удаляются ДНК, белки, углеводы и нуклеотидфосфаты.
Для выделения РНК необходимо собрать в одноразовую пробирку с 200 мкл раствора антикоагулянта (0,05М раствор ЭДТА или 4% раствор цитрата натрия) 2 мл венозной крови (гепарин не использовать!). Неохлажденные пробы хранить при +4 - +80С не более суток. Не замораживать!
Методика выделения РНК из цельной крови (с использованием набор реагентов ООО НПФ «Литех»):
1. В эппендорф внести 1 мл цельной крови и центрифугировать со скоростью 3 000 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре. В результате кровь разделится на плазму и форменные элементы. На поверхности осадка форменных элементов расположен тонкий слой лейкоцитов.
2. Аккуратно, не захватив лейкоциты, перенести плазму в чистую пробирку. Отделить плазму необходимо не позднее, чем через 2 – 6 часов. В случае необходимости сохранения образцов для исследования плазму хранить при t=+2 - +40C не более 72 часов, для более длительного хранения заморозить при -200С. Замороженную плазму хранить не более 1 месяца.
3. Образец тщательно перемешать на вортексе 10 секунд.
4. В эппендорфы объемом 1,5 мл внести по 450 мкл денатурирующего раствора и 3 мкл носителя (т-РНК). Денатурирующий раствор содержит фенол (избегать попадания на кожу и слизистые оболочки). Пронумеровать пробирки и расположить их на штативе.
5. Внести по 50 мкл исследуемой плазмы крови в эппендорфы. Пробирки перемешать на вортексе по 10 секунд, сбросить капли. Инкубировать при комнатной температуре 10 минут.
6. Добавить 100 мкл хлороформа, тщательно закрыть пробирки и перемешать на вортексе по 10 секунд.
7. Центрифугировать 5 минут при 14 000 оборотов в минуту.
8. Не задевая интерфазу, перенести до 300 мкл верхней водной фазы в чистый эппендорф, содержащий 300 мкл изопропилового спирта. Пробирки закрыть и перемешать на вортексе по 10 секунд.
9. Центрифугировать 15 минут при 14 000 оборотов в минуту. На данном этапе должен образоваться полупрозрачный рыхлый осадок.
10. Удалить супернатант при помощи вакуумного аспиратора в колбу-ловушку, оставив на дне пробирки около 20 мкл жидкости. Не допускать захвата рыхлого осадка!
11. Добавить к осадку 1 мл промывочного раствора, перемешать на вортексе 10 секунд.
12. Центрифугировать 10 минут при 14 000 оборотов в минуту.
13. Удалить супернатант как можно полнее, не захватив при этом осадок. Подсушить 30 минут при комнатной температуре, оставляя пробирки открытыми (можно в термостате при 400С). Спирт должен испариться полностью.
14. Добавить 50 мкл деионизированной воды, пробирки закрыть и инкубировать 10 минут при комнатной температуре, затем перемешать на вортексе или пипетированием.
Для определения РНК раствор сразу использовать для постановки реакции ПЦР. РНК в этом растворе не хранится!
