Почва – наиболее благоприятная среда для развития микроорганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава для учета численности в ней микроорганизмов с исследуемого участка берут среднюю пробу.
Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа, степени гетерогенности почвы и ее однородности в ботаническом отношении. Рекомендуют с площади 100 м2 брать пробу из трех точек, с площади, превышающей 100 м2 , - из пяти по методу «конверта», с 1 га и более – из 15 точек. При исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний слой толщиной 2 см; при изучении микрофлоры почвенного профиля – по генетическим горизонтам (снизу вверх).
Почвенный образец берут буром, лопатой и ножом. В поле перед взятием образца их тщательно очищают, затем обрабатывают спиртом и обжигают. Укладывают образец в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную банку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной бумагой, либо в стерильные пергаментные пакеты. На пакеты и банки наклеиваются этикетки с указанием места взятия пробы, горизонта и других сведений.
Почвенные образцы анализируют в первые сутки. При необходимости допускается хранение их в холодном помещении (в холодильнике) в течение 2 дней.
Приготовление почвенной суспензии и посев
На стерильное часовое стекло стерильным шпателем помещают 5 г почвы. Чтобы при взвешивании в почву не попали микроорганизмы из воздуха, особенно споры грибов, часовое стекло накрывают другим часовым стеклом. Предварительно стекла взвешивают. Часовые стекла и шпатели стерилизуют фламбированием. Навеску почвы переносят в стерильную фарфоровую ступку, увлажняют 0,5 мл воды и растирают пальцем в стерильной резиновой перчатке в течение 5 мин. Перед приготовлением почвенной суспензии для каждого образца готовят 2 стерильные колбы на 250 мл. Одна содержит 50 мл стерильной водопроводной воды, другая - пустая. Водой из первой колбы растертую почвенную массу смывают в пустую стерильную колбу. Колбу с полученной почвенной суспензией взбалтывают 10 мин и дают отстояться крупным частицам почвы.
Далее готовят разведения, содержащие разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого из колбы стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10-1 г почвы, и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неоднократно промывают в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Концентрация почвы в пробирке будет 10-2 г.
Другой стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии из первой пробирки и переносят ее во вторую пробирку, тщательно повторяя процедуру промывания пипетки. Концентрация почвы во второй пробирке будет 10-3 г. Точно также новыми стерильными пипетками производят дальнейшие разведения почвенной суспензии до достижения разведения 10-5 и 10-6 г.
Для определения численности микроорганизмов в каждом разведении методом питательных пластин проводят глубинный или поверхностный посев. Методы посева описаны выше. Для учета бактерий используют среду МПА, для учета микроскопических грибов – среду Чапека (см. приложение 1).
Учет численности микроорганизмов
Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы (КОЕ), которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, кусочек мицелия актиномицета или гриба.
Подсчет численности бактерий осуществляют через 24-48 часов инкубации чашек в термостате, грибов – через 7 суток, актиномицетов – через 10-14 суток.
Количество КОЕ в 1 г сырой почвы устанавливают, умножая число КОЕ в чашке на степень разведения – число, показывающее, во сколько раз в конкретном случае разбавили 1 г почвы.
Для правильного определения численности КОЕ подсчитывают только чашки, в которых колоний свыше 10 и не более 250-300.
Для сравнения количества КОЕ в разных почвах необходимо подсчитать их число в 1 г абсолютно сухой почвы. Для этого одновременно со взятием навески определяют влажность почвы. Метод определения влажности почвы приведен в приложении 2. Для определения количества КОЕ в абсолютно сухой почве необходимо число клеток в сырой почве разделить на количество абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сухой почвы.
Пример расчета. При посеве из пробирки с разведением почвенной суспензии 10-6 г на чашке выросло 18 колоний. Содержание абсолютно сухого вещества почвы составило 70%, т.е. 0,7 г сухой почвы в 1 г сырой почвы.
Число клеток (КОЕ) в 1 г сырой почвы равно 18000000.
Число клеток (КОЕ) в 1 г сухой почвы равно
(клеток)
Метод питательных пластин легко выполним, но имеет ряд недостатков, самый существенный из которых – отсутствие универсальной среды для развития всех микроорганизмов, обитающих в почве. Питание у разных бактерий специфично, и на каждой среде выделяется только физиологическая группа. Так, на наиболее часто применяемой среде мясо-пептонном агаре МПА развиваются в основном гнилостные бактерии, способные усваивать легко доступные органические формы азота. Для более полного представления о населенности почвы делают посевы на элективные среды или используют метод прямого подсчета микроорганизмов под микроскопом.
