Основные правила микроскопии (микроскопия готовых препаратов)

Световой микроскоп — это обязательная принадлежность любой микробиологической лаборатории. Разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением объекта на увеличение окуляра.

Микроскопия с сухими объективами дает увеличение в 120-600 раз. Не­достаток: часть лучей отклоняется в сторону и не достигается

хорошее освещение изучаемого объекта. Иммерсионные объективы — это объективы, которые погружают в жидкости (кедровое масло, персиковое мас­ло). Поскольку показатели преломления стекла и иммерсионного масла практи­чески одинаковы 1,52, сохраняется четкость и ясность поля зрения. Полезное увеличение микроскопа достигает 2000 раз. Современный микроскоп — это точ­ный оптический прибор, поэтому необходимо строго соблюдать ряд правил при работе с ним:

1) использовать правильное освещение;

2) хранить закрытым от пыли;

3) для чистки оптических частей применять кисточку или мягкую ткань, смоченную водой или спиртом. Раз в год микроскоп должен просматривать мастер-оптик.

Метод грамма

Метод Грама введен в 1884 году датским микробиологом Гансом Христианом Грамом и является важным таксономическим признаком.

К грамположительным бактериям относятся те, у которых комплекс, образуемый генцианвиолетом и йодом, удерживается при обработке спиртом.

Грамотрицательными называют те бактерии, которые не обладают свойством удерживать комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом.

Способность или неспособность клеток удерживать комплекс генцианвеолета с йодом связывают с различным составом и структурой клеточной стенки бактерий.

Методика окраски.

1.На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом и наносят каплю воды на 2 минуты. Генцианвиолет основная краска.

2. Бумагу сбрасывают и, не промывая водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту. Раствор Люголя протрава: усиливает действие основной краски у грамположительных бактерий.

3. Препарат обесцвечивают 3-5 каплями спирта в течение ЗОсекунд до прекращения отхождения фиолетовых струек краски. Спирт обесцвечивающий фактор.

4. Промывают водой.

5. Докрашивают водным фуксином Пфейффера в течение 1-2 минут. Водный фуксин дополнительная краска. Грамположитель-ные бактерии (кокки) сине-фиолетового цвета, грамотрицательные (палочковидные формы) розового цвета.

6. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

Метод Циль-Нильсена

Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.

Методика окраски:

1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров.	Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава.
2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают.
3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты.	Серная кислота-обесцвечивающий фактор.
4. Промывают водой
5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут	Синька Леффлера — дополнительная краска
6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией	Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета

11) Определение подвижности микроорганизмов методом «раздавленной капли»

Жгутики являются органами движения бактерий, состоят из белка флагеллина. По количеству и характеру расположения жгутиков различают бактерии, монотрихи, лофотрихи, амфитрихи и перитрихи. Жгутики обладают антиген­ными свойствами (Н-антиген) и дают возможность бактериям перемешаться вжидкой среде.

О наличии жгутиков можно судить по характеру движения бактерий в «раздавленной» и «висящей» каплях при опущенном конденсоре и частично прикрытойдиафрагме микроскопа.

Метод «раздавленной капли»

Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предмет­ное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть та­кой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рас­сматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.

Метод «висячей капли»

Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры нано­сят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предмет­ное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают по­кровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.