Световой микроскоп — это обязательная принадлежность любой микробиологической лаборатории. Разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением объекта на увеличение окуляра.
Микроскопия с сухими объективами дает увеличение в 120-600 раз. Недостаток: часть лучей отклоняется в сторону и не достигается
хорошее освещение изучаемого объекта. Иммерсионные объективы — это объективы, которые погружают в жидкости (кедровое масло, персиковое масло). Поскольку показатели преломления стекла и иммерсионного масла практически одинаковы 1,52, сохраняется четкость и ясность поля зрения. Полезное увеличение микроскопа достигает 2000 раз. Современный микроскоп — это точный оптический прибор, поэтому необходимо строго соблюдать ряд правил при работе с ним:
1) использовать правильное освещение;
2) хранить закрытым от пыли;
3) для чистки оптических частей применять кисточку или мягкую ткань, смоченную водой или спиртом. Раз в год микроскоп должен просматривать мастер-оптик.
Метод грамма
Метод Грама введен в 1884 году датским микробиологом Гансом Христианом Грамом и является важным таксономическим признаком.
К грамположительным бактериям относятся те, у которых комплекс, образуемый генцианвиолетом и йодом, удерживается при обработке спиртом.
Грамотрицательными называют те бактерии, которые не обладают свойством удерживать комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом.
Способность или неспособность клеток удерживать комплекс генцианвеолета с йодом связывают с различным составом и структурой клеточной стенки бактерий.
Методика окраски.
1.На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом и наносят каплю воды на 2 минуты. Генцианвиолет основная краска.
2. Бумагу сбрасывают и, не промывая водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту. Раствор Люголя протрава: усиливает действие основной краски у грамположительных бактерий.
3. Препарат обесцвечивают 3-5 каплями спирта в течение ЗОсекунд до прекращения отхождения фиолетовых струек краски. Спирт обесцвечивающий фактор.
4. Промывают водой.
5. Докрашивают водным фуксином Пфейффера в течение 1-2 минут. Водный фуксин дополнительная краска. Грамположитель-ные бактерии (кокки) сине-фиолетового цвета, грамотрицательные (палочковидные формы) розового цвета.
6. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.
Метод Циль-Нильсена
Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.
Методика окраски:
| 1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров. | Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава. |
| 2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают. | |
| 3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты. | Серная кислота-обесцвечивающий фактор. |
| 4. Промывают водой | |
| 5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут | Синька Леффлера — дополнительная краска |
| 6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией | Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета |
11) Определение подвижности микроорганизмов методом «раздавленной капли»
Жгутики являются органами движения бактерий, состоят из белка флагеллина. По количеству и характеру расположения жгутиков различают бактерии, монотрихи, лофотрихи, амфитрихи и перитрихи. Жгутики обладают антигенными свойствами (Н-антиген) и дают возможность бактериям перемешаться вжидкой среде.
О наличии жгутиков можно судить по характеру движения бактерий в «раздавленной» и «висящей» каплях при опущенном конденсоре и частично прикрытойдиафрагме микроскопа.
Метод «раздавленной капли»
Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предметное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть такой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рассматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.
Метод «висячей капли»
Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры наносят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предметное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.
