Микробиологическая диагностика холеры

Холера — особо опасное, карантинное инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae биоваров cholerae и eltor, проявляющееся в виде острого гастроэнтерита с выраженной интоксикацией и обезвоживанием (эксикозом) в результате нарушения водно-электролитного обмена, cвязанного с выработкой вибрионами холерного энтеротоксина (холерогена).

Основной метод лабораторной диагностики холеры – бактериологический.

При выполнении исследований на холеру необходимо строго соблюдать требования противоэпидемического режима. Материал для исследования на холеру собирают в стерильную посуду, не содержащую следов дезинфицирующих растворов, упаковывают и доставляют в лабораторию. Банки, пробирки должны быть герметично закрыты водонепроницаемыми пробками, которые заливают парафином, посуду обвязывают двойным слоем вощеной бумаги и обрабатывают дезинфицирующим раствором. В направлении указывают фамилию, инициалы, возраст больного, его домашний и служебный адрес, диагноз, даты начала болезни и госпитализации, дату и час взятия материала, а также фамилию и инициалы лица, направившего анализ. Банки и пробирки с материалом для исследования перекладывают ватой, помещают, в металлическую коробку, а затем в деревянный ящик, который пломбируют, надписывают «Верх, осторожно» и на служебном транспорте с сопровождающим лицом пересылают в лабораторию в течение 2 часов после взятия проб.

Исследования на холеру проводятся круглосуточно в специальной лаборатории медицинскими работниками, прошедшими подготовку по особо-опасным инфекциям. Методы, применяемые для микробиологической диагностики холеры, представлены в схеме 13.

Микроскопический метод (микроскопия окрашенных мазков и препаратов «висячей капли» из материала от больного) при холере в настоящее время не применяется в связи с низкой его информативностью. Разработаны методы экспресс-диагностики холеры (РИФ).

Бактериологический метод состоит из нескольких этапов.

Первый этап. Исследуемый материал засевают на щелочные (элективные) плотные питательные среды (щелочной агар Монсура – МПА с триптиказой, хлоридом натрия, таурохолатом натрия, карбонатом натрия; TCBS - тиосульфат-цитрат-бромтимол-сахарозный агар;щелочной МПА) и жидкие среды обогащения (1% щелочная пептонная вода).

Второй этап проводится через 6 —8 ч от начала анализа. Выполняют пересев из верхней части 1-й среды накопления на плотные элективные питательные среды и на 2-ю среду накопления. При наличии на 1-й пептонной воде нежной голубоватой пленки из нее готовят мазок в окраске по Граму, в котором обнаруживают грамотрицательные изогнутые в виде «запятой» вибрионы, проверяют подвижность, ставят ОРА с холерными сыворотками О-1, О-139 и RO, а также специфическую иммунофлюоресценцию.

Третий этап выполняется через 12— 14 ч от начала анализа. Производится пересев из верхней части 2-й среды накопления на плотные элективные питательные среды. Изучают и отбирают для исследования типичные для холерного вибриона колонии на плотных средах, засеянных нативным материалом.

Схема 13. Микробиологическая диагностика холеры

Экспресс-методы: прямая и непрямая РИФ, РНГА с иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами, реакция иммобилизации вибрионов с противохолерными сыворотками с целью обнаружения холерного вибриона в исследуемом материале.

Четвертый этап. (через 18-24 ч от начала анализа). Изучают и отбирают с помощью стереомикроскопа типичные для холерного вибриона колонии на всех плотных средах. Холерный вибрион образует прозрачные, круглые, диаметром 1-2 мм, гладкие, плоские, гомогенные, с ровными краями колонии, имеющие голубоватый оттенок и маслянистую консистенцию. На агаре TCBSколонии холерного вибриона ярко-желтые на зеленом фоне среды, на среде Монсура — полупрозрачные бесцветные с темным центром. Колонии проверяют на наличие оксидазы (холерные вибрионы оксидазоположительны), ставят РА на стекле с холерными сыворотками О-1, О-139 и RO, а также специфическую иммунофлюоресценцию.

Положительная РА или ИФМ в сочетании с типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами выделенной культуры позволяет выдать предварительный положительный ответ.

Пятый этап проводится через 24 —36 ч от начала исследования. На этом этапе изучают и отбирают характерные для холерного вибриона культуры на среде Ресселя, на которой холерный вибрион расщепляет сахарозу, что сопровождается покраснением среды в столбике без образования газа, но не ферментирует лактозу (отсутствие изменений скошенной части среды). Со среды Ресселя готовят мазки в окраске по Граму с целью обнаружения характерных по морфологическим свойствам вибрионов, проверяют наличие подвижности и оксидазы, ставят РА с холерными сыворотками (О-1, RO,Огава, Инаба, при отрицательном результате - с сывороткой О-139) и при наличии положительных результатов выдают ответ о выделении соответствующего холерного вибриона.

Окончательную идентификацию оксидазопопожительных культур проводят, используя сокращенную или полную схемы (табл. 15).

Таблица 15. Дифференциация холерных вибрионов

Тесты	V.cholerae asiaticae	V.cholerae el-tor	НАГ
Агглютинация О-сывороткой	+	+	-
Агглютинация сыворотками Инаба и Огава	+	+	-
Лизис фагами: Холерный фаг С (фаг IV) Фаг Эль-Тор	+ -	- +	+ +
Агглютинация куриных эритроцитов	-	+	+
Гемолиз эритроцитов барана	-	+	+
Рост на среде с полимиксином	-	+	+
Гексаминовый тест	-	+	+
Реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола)	-	+	+

Сокращенная схема предполагает постановку развернутой РА с сыворотками Инаба и Огава, пробы с диагностическими холерными фагами, определение ферментативной группы по Хейбергу. Полная схема дополнительно включает тесты для дифференциации биоваров холерного вибриона (классического и Эль-Тор), в частности, определение гемагглютинирующих и гемолитических свойств, чувствительности к полимиксину, способности давать положительную реакцию Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола - ацетоина из глюкозы). Ацетоин определяют добавлением в культуру, выращенную на глюкозо-фосфатном бульоне Кларка, 5% α-нафтола и 40%-го гидроксида калия; при встряхивании пробирок среда окрашивается в розовый или рубиново-красный цвет.

Для ускоренной биохимической идентификации холерных вибрионов и их дифференциации от холероподобных и нехолероподобных вибрионов используют систему индикаторных бумажных дисков (СИБ), в состав которой входят тесты на оксидазу, индол, ферментацию лактозы, глюкозы, сахарозы, маннозы, арабинозы, маннита, инозита, аргинина, лизина и орнитина.

Шестой этап (выполняется через 36-48 ч от начала анализа) - окончательная идентификация выделенных культур, определение их чувствительности к антибиотикам, формулировка окончательного ответа о выделении холерного вибриона с указанием биовара, серогруппы (серовара) и эпидемической значимости по косвенным биологическим признакам (гемолитической активности, группе Хейберга и др.). Типичные культуры Vibrio cholerae представляют собой грамотрицательные изогнутые в виде запятой или прямые полиморфные активно подвижные палочки, обладающие оксидазой, разлагающие глюкозу с образованием кислоты без газа, декарбоксилирующие лизин и орнитин, но не ферментирующие аргинин, принадлежащие к 1-й (реже 2-й) группе Хейберга, агглютинирующиеся холерными сыворотками и лизирующиеся диагностическими фагами. Если выделенная культура не агглютинируется сыворотками к О1 и О139, ее относят к группе НАГ-вибрионов, а при наличии соответствующих сывороток определяют ее принадлежность к другой серогруппе. Токсигенные штаммы холерных вибрионов серогрупп Ои О139 обычно не лизируют бараньи эритроциты, относятся к 1-й группе Хейберга (ферментируют маннозу и сахарозу, но не арабинозу), лизируются определенными фагами в комплексном методе с применением ХДФ.

Вирулентность холерных вибрионов определяют в специализированных лабораториях путем внутрикишечного заражения кроликов-сосунков, а также методами генодиагностики (ПЦР или ДНК-ДНК-гибридизация с целью определения гена, ответственного за выработку токсина).

Серодиагностика является дополнительным методом лабораторной диагностики холеры. Исследуют парные сыворотки крови больных, взятые с интервалом в 6-8 дней, с целью выявления агглютининов с помощью РА (диагностический титр 1:40 и выше), антитоксинов с помощью РНГА с эритроцитарным холерным энтеротоксическим диагностикумом (диагностический титр - 1: 160) и вибриоцидных антител с помощью реакции иммобилизации вибрионов (диагностический титр1:1000). Учитывается также нарастание титра антител (не менее чем в 4 раза) в процессе инфекции.

Экспресс-диагностика -прямая и непрямая РИФ с использованием специфических О-холерных сывороток серогрупп 01 и 0139, меченых изотиоцианатом флюоресцеина; РНГА со специфическими иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами. Ставят также реакцию иммобилизации вибрионов с теми же сыворотками (2 капли материала наносят на предметное стекло, в одну из них вносят каплю сыворотки О1 или О139 в разведении 1: 100, в другую каплю ФР - контроль). Готовят препараты «раздавленной» капли, которые исследуют с помощью темнопольного, фазово-контрастного или обычного микроскопа с опущенным конденсором при увеличении 400 - 600. Положительная реакция характеризуется потерей подвижности вибрионов и их склеиванием.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопический метод. Промикроскопировать и зарисовать демонстрационный микропрепарат холерного вибриона V.cholerae, окрашенный по Граму. Холерный вибрион - грамотрицательная изогнутая палочка.

2. Бактериологический метод. Ознакомиться с основными биологическими свойствами классического биовара холерного вибриона и биовара Эль-Тор:

· фаголизабельность. Классический холерный вибрион лизируется фагом С и нечувствителен к действию фага Эль-Тор II. Вибрион Эль-Тор лизируется фагом Эль-Тop и нечувствителен к фагу С (демонстрация);

· чувствительность к полимиксину. Учесть рост классического холерного вибриона и вибриона Зль-Тор на среде с добавлением полимиксина. Вибрион Эль-Тор к полимиксину не чувствителен, классический холерный вибрион – чувствителен;

· гемолитические свойства. Вибрион Эль-Тор лизирует эритроциты; классический холерный вибрион, как правило, нет (демонстрация);

· определение серовара холерного вибриона. Учесть развернутую реакцию агглютинации c сыворотками Инаба и Огава (демонстрация).

3. Изучить биопрепараты, используемые для диагностики, лечения и профилактики бактериальной дизентерии и холеры:

· люминесцирующая холерная сыворотка для постановки реакции иммунофлюоресценции с целью выявления вибрионов;

· агглютинирующие холерные сыворотки Инаба и Огава (для постановки реакции агглютинации при идентификации холерного вибриона);

· холерные фаги: классический (фаг С) и Эль-Тор. Используются для фагодиагностики;

· поливалентный холерный бактериофаг для лечения и профилактики;

· холерная вакцина. Создано 3 вакцины против холеры (убитая Эль-Тор; холероген- анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона для подкожных инъекций; холероген-анатоксин, обогащенный О-антигеном холерного вибриона таблетированный). Используются для специфической профилактики холеры.