Тема: методы оценки иммунного статуса организма человека

Леч., пед. ф-ты

ЗАНЯТИЕ 9

 

Тема: МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

Цель: Освоить методы оценки неспецифических и специфических факторов защиты организма человека.

Знать: Неспецифические и специфические факторы защиты организма человека и методы их изучения.

 

Уметь:

1. Определить неспецифические гуморальные и клеточные факторы защиты организма человека.

2. Учесть и оценить результаты реакции розеткообразования для определения процентного содержания Т- и В-лимфоцитов.

 

Контрольные вопросы:

1. Понятие «иммунитет» и его виды.

2. Неспецифические клеточные факторы иммунитета человека: кожа и слизистые оболочки; нормальная микрофлора; фагоцитоз; их характеристика.

3. Виды фагоцитирующих клеток, стадии фагоцитоза, завершенный и незавершенный фагоцитоз.

4. Неспецифические гуморальные факторы иммунитета человека: комплемент, лизоцим, пропердин, интерферон, железосвязывающие белки и др.; их характеристика.

5. Центральные и периферические органы иммунной системы.

6. Основные клетки иммунной системы: Т- и В-лимфоциты, макрофаги.

7. Т-лимфоциты. Субпопуляции Т-клеток: Т-хелперы, цитотоксические Т-клетки (Т-эффекторы); поверхностные маркеры и рецепторы этих клеток (СД-антигены). Продукты и функции Т-лимфоцитов.

8. В-лимфоциты. Субпопуляции В-клеток. Поверхностные маркеры и рецепторы В-клеток: иммуноглобулины, Fc-рецепоры, рецепторы для комплимента и др. Продукты и функции В-лимфоцитов.

9. Взаимодействие Т-, В-лимфоцитов и макрофагов в процессе иммунного ответа.

 

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Определить бактерицидные свойства кожи.

2. Определить наличие лизоцима в слюне.

3. Определить фагоцитарную активность полиморфно-ядерных лейкоцитов.

4. Определить содержание Т-лимфоцитов в крови обследуемого.

 

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

 

I. Определение бактерицидных свойств кожи.

Учет результатов по определению бактерицидных свойств кожи с использованием тест-культуры Sarcina flava проводится через 18-24 ч после термостатирования посевов при 37°С:

- I сектор – рост нормальной микрофлоры кожи;

- II сектор – рост тест-культуры сарцины;

- III сектор – отсутствие роста сарцины и рост нормальной микрофлоры или рост сарцины

разной степени интенсивности и рост нормальной микрофлоры.

Оценка результатов: отсутствие роста сарцины в III секторе спустя 30 мин, свидетельствует о бактерицидных свойствах кожи; наличие роста сарцины свидетельствует о снижении бактерицидных свойств кожи.

 

Неповрежденные кожа и слизистые оболочки являются барьером для проникновения микроорганизмов. Причем, они являются не только механическим барьером, а снабжены активными механизмами: на коже это жирные кислоты (секрет сальных желез), молочная кислота, NaCl (секрет потовых желез), нормальная микрофлора. На слизистых это лизоцим, пероксидаза, лактоферрин (слюна, слезы и др.), соляная кислота (желудочный сок), нормальная микрофлора. Поэтому условием проникновения в организм большинства возбудителей является повреждение кожи и слизистых оболочек.

 

II. Определение наличия лизоцима в слюне.

Учет и оценка результатов по определению лизоцима в слюне с использованием тест-культуры Micrococcus luteus проводится через 18-24 часа после термостатирования при 37°С: по всей поверхности чашки отмечается рост микрококка, а в месте нанесения слюны роста тест-культуры нет, но имеется рост нормальной микрофлоры полости рта, нечувствительной к лизоциму.

 

Лизоцим является одним из важнейших компонентов слюны, определяющий ее бактерицидные и бактериостатические свойства. Концентрация лизоцима в слюне взрослых составляет 59-139 мкг/мл; в сыворотке крови взрослого – 4-10 мкг/мл, в молоке кормящей матери - 75 мкг/мл. Лизоцим является ферментом мурамидазой, расщепляющим гликозидные связи в молекуле муреина, входящего в состав клеточной стенки бактерий. Он вызывает бактерицидный эффект, в первую очередь, в отношении грамположительных бактерий, причем резидентная микрофлора различных экотопов устойчива к действию лизоцима.

 

III. Определение фагоцитарной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов.

Фагоцитоз – является одним из основных клеточных неспецифических механизмов защиты организма человека. Для определения активности фагоцитоза кровь или взвесь лейкоцитов обследуемого инкубируют с частицами латекса, после чего из смеси готовят тонкий мазок и окрашивают его по методу Романовского-Гимзе.

Промикроскопируйте готовые препараты для определения активности фагоцитоза лейкоцитов крови с использованием частиц латекса, учтите и оцените полученные результаты.

Критерии учета: подсчет поглощенных частиц латекса ведут в 100 нейтрофилах. Интенсивность реакции оценивают по следующим показателям:

1) фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность) – процент нейтрофилов, содержащих частицы латекса;

2) фагоцитарное число (фагоцитарный индекс) – среднее число микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом.

Критерии оценки: интенсивность реакции фагоцитоза в норме – фагоцитарный показатель у детей 60%, у взрослых 75-80%, фагоцитарное число – у детей 12, у взрослых 14-15 (региональные показатели по данным Центра СПИД, г. Красноярск).

 

IV. Определение содержания Т-лимфоцитов в крови обследуемого.

Для определения процентного содержания Т-лимфоцитов учтите и оцените результаты реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК).

 

Т- и В-лимфоциты выявляют по их способности фиксировать на своей поверхности соответственно эритроциты барана и мыши с образованием розеток (Е-РОК). В-лимфоциты, обладающие рецепторами для иммуноглобулина G и комплемента выявляют также по способности формировать розетки с эритроцитами, погруженные этими белками (ЕАС-РОК).

Для постановки Е-РОК с целью определения Т-лимфоцитов смешивают лимфоциты, выделенные из крови обследуемого и эритроциты барана, инкубируют при 4°С и центрифугируют. Эритроциты присоединяются к специальным рецепторам на мембране Т-лимфоцитов, образуя так называемые розетки. Осадок, содержащий розетки, осторожно ресуспендируют и готовят мазки, которые окрашивают метиленовым зеленым, пиронином.

Учет результатов: подсчитывают количество розеткообразующих клеток на 100 лимфоцитов и выражают в процентах. Розеткообразующим считают лимфоцит, присоединивший не менее 3-х эритроцитов барана.

Оценка результатов: у здоровых людей Т-лимфоциты составляют 40-70% от общего числа лимфоцитов, В-лимфоциты – 10-30%.

 

Вопросы для самоконтроля:

1. Пути активации комплемента и механизм его бактерицидного действия. Какой путь активации является врожденной реакцией иммунитета.

2. Чем объясняется более высокая активность лизоцима в отношении грамположительных микроорганизмов?

3. Свойства нормальной микрофлоры организма человека, определяющие ее роль как неспецифического фактора иммунитета.

4. Роль интерферона в защите организма человека.

5. Чем объясняется разница в активности фагоцитоза в неиммунном и иммунном организме и с чем это связяно?

6. Какие особенности лимфоцитов определяют их разделение на Т- и В-лимфоциты и их субпопуляции?

7. Что собой представляют клеточные компоненты лимфоцитов СД и какими методами их можно определить?

8. Суть Е- и ЕАС-розеткоообразования для определения количества лимфоцитов.

 

Литература:

Учебники:

1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2002. – С. 215-261, 322-325.

2. Медицинская микробиология / Гл. ред. В. И. Покровский, О. К. Поздеев. – М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. – С. 77-100.

3. Медицинская микробиология, иммунология, вирусология / Под ред. Л. Б. Борисова, А. М. Смирновой. - М.: Медицина, 1994. – С. 170-180, 192-201, 225-226.

4. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 190-207, 232.

5. Тимаков В. Д., Левашев В. С., Борисов Л. Б. Микробиология. - М.: Медицина, 1983. – С. 171-180, 216-218.

 

Практикумы:

1. Борисов Л. Б., Козьмин-Соколов Б. Н., Фрейдлин И. С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – М.: Медицина, 1993. – С. 90-94.