План занятия
1. Общая характеристика микробного паразитизма.
2. Понятие об инфекции, инфекционном процессе, инфекционном заболевании.
3. Патогенность и вирулентность микроорганизмов.
4. Биологический метод изучения микрорганизмов. Экспериментальное заражение животных.
5. Определение вирулентности микроорганизмов с помощью биологических проб на лабораторных животных.
Задания для самостоятельной работы студентов
1. Изучить микрофлору зева и кожи рук с помощью бактериоскопического и бактериологического методов. Записать результаты и зарисовать полученные микропрепараты.
2. Определить вирулентность пневмококка на белых мышах, записать результат в таблице 5.
Таблица 5.
Схема постановки опыта определения вирулентности пневмококка.
| Количество микробных тел в 1 мл | 500 млн. | 250 млн. | 125 млн. | 62,5 млн. |
| Количество зараженных мышей | ||||
| Количество погибших мышей |
3. Оцените результаты реакции нейтрализации токсина антитоксческой сывороткой на мышах. I группе мышей введены исследуемый потенциально токсический материал вмести с соответствующей специфической антитоксической сывороткой, II группе только исследуемый материал, III группа – интактные (контроль):
А) во всех группах мыши остались живы.
Б) в первой и третьей группах мыши живы, во второй - погибли.
В) во всех группах животные погибли.
Г) в первой и второй группе мыши погибли.
Вопросы для самоконтрля знаний и обсуждения
1. Виды симбиоза между микробами и макроорганизмом (мутуализм, комменсализм, паразитизм). 2. Паразитизм, его виды, характеристика. 3. Паразиты факультативные и облигатные. Условно-патогенные микроорганизмы, их роль в патологии человека. 4. Инфекция, инфекционный процесс, инфекционная болезнь, определение понятий. 5. Факторы, определяющие течение инфекционного процесса (свойства микроба, состояние макроорганизма, условия внешней среды, социальные факторы). 6.Этапы инфекционного процесса (адгезия, колонизация, инвазия, пенетрация, генерализация процесса), характеристика этих стадий. 7. Основные признаки инфекционного заболевания. 8.Тропизм микробов к определенным клеткам и тканям. 9. Стадии инфекционной болезни (инкубация, продрома, стадия выраженных клинических проявлений, исход болезни). 10. Патогенность и вирулентность микроорганизмов – определение понятия, характеристика, критерии патогенности. 11. Методы измерения вирулентности. 12. Бактериологическое исследование трупов павших животных: вскрытие и исследование наружных покровов, грудной и брюшной полости. 13. Определение вирулентности микроорганизмов с помощью биологических проб на лабораторных животных. 14. Реакция нейтрализации на животных, ее практическое применение.
Дополнительный материал
Биологический метод направлен на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Суть метода включает - заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена, либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь (per os), в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки различных органон, СМЖ, экссудат из различных полостей (рис.).
Реакция нейтрализации на животных. Проводят с целью обнаружения токсинов в исследуемом материале. Реакция нейтрализации экзотоксина происходит при его взаимодействии с антитоксической сывороткой (содержит антитела-антитоксины). В результате образовании комплекса антиген-антитело токсин теряет свои ядовитые свойства.
Токсины получают путем фильтрования исследуемого материала, где потенциально размножались токсигенные бактерии. В лаборатории находятся анатоксические сыворотки к определенным токсинам.
Для определения типа токсина в исследуемом материале его смешивают с антитоксической сывороткой в соответствие с потенциальным токсином. Эту смесь вводят белым мышам (1-я группа). Для контроля берут еще две группы животных: одной вводят исследуемый материал без антитоксина (2-я группа), другую оставляют без вмешательства (3-я группа – интактные животные - контроль).
При совпадении (нейтрализации) токсина и антитоксической сыворотки мыши первой группы не погибают, во-второй – летальный исход, в третье также все животные живы, так как им не вводился ни исследуемый материал, ни антитоксическая сыворотка.
Тема: Учение об инфекции (продолжение). Факторы патогенности микроорганизмов.
Цель занятия: изучить факторы патогенности микробов, обеспечивающие адгезивность, инвазивность, агрессивность, токсичность и токсигенность; освоить методы выявления основных факторов патогенности
План занятия
1. Факторы патогенности микроорганизмов.
2. Методы определения факторов патогенности.
3. Эпидемический процесс. Роль макроорганизма в развитие инфекционного процесса.
4. Формы инфекционного процесса.
5. Распространение инфекционных заболеваний в популяции
Задания для самостоятельной работы студентов
1. Изучить действие бактериальных токсинов на макроорганизм.
На белых мышах воспроизвести эндотоксический шок. Для этого взвесь в физиологическом растворе суточной культуры протея вводят внутрибрюшинно белой мыши. Вторую мышь оставить незараженной для контроля. В течение всего занятия вести наблюдение за развитием симптомов эндотоксиновой интоксикации.
Объяснить механизм освобождения токсина, его действие на организм. Можно ли назвать данный инфекционный процесс инфекционной болезнью? Записать ответ в тетради.
2. Промикроскопировать мазки-отпечатки, приготовленные из внутренних органов мыши, погибшей спустя 24 часа после заражения внутрибрюшинно взвесью капсульной палочки (грамотрицательные бактерии). При микроскопии отметить наличие микробов, их морфологию, количество, наличие у них капсулы. Сделать вывод о форме инфекционного процесса (токсинемия или сепсис)?
3. Определить факторы патогенности 3-х исследуемых культур стафилококков. Для этого:
а) изучить на цитратной плазме характер роста стафилококков – отсутствие или наличие свертывания плазмы (плазмокоагулазная активность);
б) определить гиалуронидазную активность стафилококков, учесть результаты.
Готовую взвесь исследуемой культуры бактерий на физиологическом растворе разливают в ряд пробирок с 0,5 до 0,1 мл. В каждую пробирку с разведенной культурой добавляют одинаковое количество гиалуроновой кислоты. После инкубации в термостате (15 минут) и на холоде (5 минут) добавляют уксусной кислоты. Если исследуемая культура не обладает гиалуронидазной активностью, то при добавлении уксусной кислоты наблюдается коагуляция гиалуроновой кислоты и выпадение ее в осадок в виде сгустка муцина.При наличии гиалуронидазной активности и достаточной концентрации фермента происходит расщепление гиалуроновой кислоты, что не ведет к образованию сгустка. Титром гиалуронидазы считается то наименьшее количество взвеси бактерий, которое еще препятствует появлению сгустка муцина под действием уксусной кислот;.
в) на кровяном агаре отметить наличие или отсутствие зон гемолиза вокруг колоний стафилококков (зона просветления агара вокруг колоний);
г) на желточно-солевом агаре отметить наличие или отсутствие вокруг посева культур зоны просветления или помутнения среды (расщепление или преципитация лецитина), по наличию которых делается вывод о лецитиназной активности микробов.
Полученные данные по изучению факторов патогенности у изученных видов стафилококков внести в таблицу:
| N | Культуры | Гемолиз | Плазмокоагулаза | Лецитиназа | Гиалуронидаза |
4. Заполнить таблицу «Факторы патогенности микроорганизмов и методы их изучения».
Таблица
Факторы патогенности микроорганизмов и методы их изучения
| Фактор патогенности | Механизм действия | Методы определения |
| Факторы адгезии | ||
| 1. Пили | Лиганд-рецепторное взаимодействие | Электронная микроскопия |
| 2……… | ||
| Факторы инвазии | ||
| 1. Гиалуронидаза | Расщепляет гиалуроновую кислоту в составе соединительной ткани и сосудистой стенке, способ-ствуя распространению микробов по межклеточ-ным пространствам и проникновению в сосу-дистое русло. Повышает сосудистую проница-емость, развитию отека с выходом биологически активных веществ. | Готовую взвесь исследуемой культуры бактерий на дистиллированной воде разливают в ряд пробирок с 0,5 до 0,1. В каждую пробирку с разведенной культурой добавляют одинаковое количество гиалуроновой кислоты. После инкубации в термостате – 15 минут и 5 минут на холоде добавляют уксусной кислоты. Если исследуемая культура не обладает гиалуронидазной активностью, то при добавлении уксусной кислоты наблюдается коагуляция гиалуроновой кислоты и выпадение ее в осадок в виде сгустка муцина. |
| 2…… | ||
| Факторы агрессии | ||
| 1. Капсула | Нарушает процесс переваривания микробов фагоцитами. Способствует незавер-шенному фагоцитозу. | Микроскопический (окраска по Бури-Гинсу). незавершенного фагоцитоза. |
| 2…… | ||
| Токсинообразование | ||
| 1. Экзотоксины: ……………….. 2. Эндотоксин |
Вопросы для самоконтрля знаний и обсуждения:
1. Характеристика факторов патогенности: а) адгезивность; б) инвазивность; в) факторы агрессии; г) токсины. 2. Методы определения факторов патогенности. 3. Эпидемический процесс, его структура. 4. Механизмы и пути передачи возбудителей и распространения микробов по организму. 5. Роль макроорганизма, окружающей среды и социальных условий в возникновении и развитии инфекционного процесса 6. Понятие о бактериемии, септицемии, септикопиемии, токсинемии и сепсисе. 7. Формы инфекционного процесса по происхождению (экзогенная, эндогенная), по числу инфекционных агентов (моно- и микст-инфекция), по характеру встреч с возбудителем (первичная, вторичная, рецидив, реинфекция, суперинфекция). 8. Формы инфекционных болезней по их распространению в человеческой популяции (спорадические заболевания, эпидемии, пандемии), по остроте процесса (острая, подострая, хроническая)
| Особенность токсина | Экзотоксины | Эндотоксины |
| Продуцент | Грамположительные и грамотрицательные бактерии | Грамотрицательные бактерии |
| Локализация | Внутри- и внеклеточная | Внутриклеточная |
| Химическая природа | Пептиды | Комплексы «белок-ЛПС» |
| Стабильность при 100 °С | Лабильны | Стабильны |
| Инактивация формальдегидом | Инактивируются | Не инактивируются |
| Биологическая активность | Индивидуальная для каждого токсина | Общая для всех токсинов |
9. Бактерионосительство, его характеристика (транзиторное, постоянное, «злостное»). Причины микробного носительства.
Дополнительный материал.
Бактериемия (от др.-греч. βακτηρία и αἷμα — кровь) — наличие бактерий в крови. Септицемия – бактерии размножаются в крови. Септикопиемия – форма сепсиса, характеризующаяся образованием гнойных метастазов во внутренних органах (чаще – в лёгких и почках). Токсинемия – состояние, при котором бактериальный экзотоксин или иной токсин циркулирует в кровеносной системе и доставляется ею к клеткам-мишеням.
Таблица.
Сравнительная характеристика экзо- и эндотоксинов
Экзотоксины
Экзотоксины являются продуктами метаболизма микробов и обычно выделяются в окружающую среду и могут оказывать действие вне микроба-продуцента.
Строение экзотоксинов
По химической природе экзотоксины являются белками. Они малоустойчивы к действию света, кислорода и температуры (разрушаются при t=60-80˚ в течение 10-60 мин).
В структуре экзотоксина выделяют 2 части (рисунок):
|  | |||
|
|
Рис. Строение экзотоксина
2. По строению экзотоксины делятся на: 1 - простые, 2 - сложные.
Простые токсины образуются в виде единой полипептидной цепи или протоксина неактивного в функциональном отношении. Под действием протеаз они превращаются в активную бифункциональную В-А- структуру. Субъединица А обладает ферментативной активностью и действует только при наличии субъединицы В.
Сложные токсины представляют готовую сложную бифункциональную В-А-структуру, которая состоит:
1) из В-субъединиц - одной или нескольких, они взаимодействуют со специфическими рецепторами клеток макроорганизма; 2) из А-субъединицы, под действием протеаз она диссоциирует на 2 субъединицы: А1-активатор и А2–субъединицу, последняя осуществляет транспорт активатора-А1 через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму клетки-мишени.
Субъединицы В и А синтезируются в клетке независимо друг от друга, а за-тем собираются в единый комплекс. За их выработку отвечают tox+-гены, которые могут находиться: в бактериальной хромосоме, в плазмидах, в умеренном бактериофаге (феномен фаговой конверсии).
Особенности экзотоксинов:
1 - вызывают явление потенцирования, когда под влиянием смеси токсинов происходит более выраженная интоксикация организма.
2 - строение молекул экзотоксинов имитирует структуру субъединиц гормонов, ферментов и нейромедиаторов. Это делает их антиметаболитами жизненноважных соединений организма, блокирующих их функциональную активность. Они первоначально имитируют действие, а в последующем
3 - это полноценные тимусзависимые антигены. К ним образуются нейтрализующие антитела – антитоксины. Протективным действием обладают антитела к фрагменту В, которые блокируют прикрепление токсина к специфическому рецептору клетки-мишени.
4 - заболевания, в патогенезе которых основная роль принадлежит белковых экзотоксинам, называются токсинемическими инфекциями (ботулизм, столбняк, анаэробная газовая раневая инфекция, дифтерия). Основным методом лечения этих заболеваний является не антибиотикотерапия, а введение антитоксинов – антитоксической сыворотки или специфических иммунглобулинов.
Взаимодействие белковых экзотоксинов с клетками-мишенями происходит в несколько стадий:
I стадия: белковый токсин за счет своей абордажной или рецепторной части В взаимодействует со специфическим рецептором ганглиозидной, гликопротеиновой или гликолипидной природы и фиксируется на поверхности клетки-мишени. Образуется комплекс: токсин + рецептор клетки.
II стадия: за счет протеаз клеточного или микробного происхождения в ре-зультате ограниченного протеолиза идет образование бифункциональной В-А-структуры. У сложных токсинов неактивная субъединица-А переводится в активные формы А1 и А2. А1-субъединица приобретает ферментативную активность.
III стадия: трансмембранная транслокация части А или А1 в цитоплазму клетки-мишени, где она нарушает жизненноважные биохимические процессы.
