Виробництво медичних, комерційних антирабічних вакцин з мозку вівці, кози, кролика, новонародженої миші, щура або з шкірно-м'язової тканини качиного зародка, заражених адаптованим до центральної нервової системи нейротропними штамами вакцинного вірусу і інактивованих фенолом, ефіром, β-пропіолактоном або ультрафіолетовим промінням, засноване на розмноженні вакцинного вірусу in vitro. Істотним недоліком цих вакцин є високий вміст в них баластної мозкової або шкірно-м'язової тканини, тому нервово-тканинні антирабічні вакцини викликають нейропаралітичні ускладнення з частотою від 1: 500 до 1: 17 000.
Антирабічна вакцина виготовляється в культурі клітин (Vaccinum antirabicum culturalis inactivatum), є принципово новим препаратом в трьох аспектах: 1) розмноження вакцинного вірусу здійснюється in vitro; 2) вірус, що використовується як вакцинний штам, адаптований до клітин нирки і тому володіє низькою нейровірулентною активністю (нейротропні штами цього віруса не розмножуються в культурі клітин внутрішніх органів без попередньої адаптації); 3) вакцина повністю вільна від баластної мозкової тканини і містить мінімальну кількість клітинного детриту.
З 1974 р. в Інституті поліомієліту і вірусного енцефаліту АМН СРСР організовано промислове виробництво цієї вакцини.
Характеристика препарату. Вакцина є культурою атенуїрованого вірусу сказу (штам Внуково-32), вирощеною в культурі первинних клітин нирок молодих сирійських хом'яків (ПСХ), інактивовану ультрафіолетовим промінням і ліофілізованую із замороженого стану в умовах вакууму.
Штам Внуково-32, як і штам ЕRА, є одним з генетичних варіантів штаму SАD. Останній був виділений з мозку собаки і фіксований після 130 церебральних пасажів на білих мишах. Згодом він пройшов 25 почергових пасажів через організм миші при інтрацеребральному зараженні і в культурі первинних клітин ПСХ.
В Інституті поліомієліту і вірусного енцефаліту АМН СРСР після 10 додаткових почергових пасажів цей штам підтримується виключно в культурі первинних клітин ПСХ при зниженій температурі (32°С). Зниження його нейротропності і патогенної активності для тварин помічено після 31 серійного пасажу в культурі клітин ПСХ при 32°С. Інша лінія штаму SАD під назвою ЕRА, атенуйована в результаті 30 серійних пасажів в культурі первинних клітин нирки новонародженого поросяти, як жива культуральна антирабічна вакцина за кордоном має широке використання для профілактичної імунізації сільськогосподарських тварин і собак. Культуральна антирабічна вакцина з штаму ЕRА за імуногенною активністю і нешкідливістю визнана кращим сучасним препаратом для використання у ветеринарній практиці.
До клітинної системи висуваються наступні основні вимоги: високе накопичення вакцинного, вірусу, відсутність онкогенних і спонтанних контамінантів, економічність, тому обрані первинні клітини нирок сирійського хом'яка.
Із одної пари нирок сирійського хом'яка готується в середньому 400мл напівфабрикату вакцини, з 4 сирійських хом'яків можна приготувати стільки культуральної антирабічної вакцини, скільки вакцини типу Фермі з мозку однієї вівці.
Технологічна схема процесу виробництва вакцини ділиться на наступні етапи: збір і трипсинізація нирок, вирощування моношару клітин, зараження кліток і їх інкубація збір вірусовмісного матеріалу, введення в серію, освітлювання, інактивація вірусу, розлив у флакони і ліофілізація.
Трипсинізацію тканин нирки проводять 0,25% розчином трипсину при кімнатній температурі і постійному перемішуванні. Після триразового промивання сольовим розчином клітини ресуспендують в 0,5% розчині гідролізату лактальбуміну (ГЛА) на сольовому розчині Хенкса (рН 7,0-7,1), що містить 30% нормальної сироватки великої рогатої худоби, в концентрації 400 000 клітин в 1 мл, в об'ємі 300 мл вносять у півторалітрові флакони для культивування клітин і інкубують при 37°С.
Через 5-6 діб після посіву клітин флакони з суцільним моношаром, без ознак дегенерації відбирають для зараження: середовище видаляють, клітини промивають 3 рази (по 150 мл сольового розчину) і вносять посівний вірус у дозі 0,01-0,001 LD50 на клітину. Адсорбцію вірусу проводять при 22°С протягом 1 год. Потім в кожний флакон вносять 300 мл 0,5 % розчину ГЛА на розчині Ерла (рН 7,4), що містить 3% людського альбуміну (початковий, розчин альбуміну містить 20% білка).
При, зараженні в суспензії трипсинізовані і відцентрифуговані клітини ПСХ суспендують в середовищі росту і вносять посівний вірус з розрахунку 0,01-0,005 LD50 на клітину. Адсорбцію вірусу проводять при 22-23°С протягом 11/2 год. Потім суспензію інфікованих клітин переносять в середовище розводячи до концентрації 400 000 клітин в 1 мл, розливають у флакони і поміщають в термальну кімнату при 37°С до утворення моношару. Заражені клітини інкубують при 32°С. Збір вірусу проводять через сифон, починаючи з 9-го дня з моменту зараження клітин. Надалі збір вірусу здійснюють з інтервалами 2-3 дні. Вірус збирають з флаконів з нормальним моношаром клітин. Вірусовмісна культуральна рідина, зібрана одночасно з однієї серії клітинної культури, складає первинний збір. Останній зберігають при -20°С. Після відповідних контрольних досліджень проб первинного збору складають серію напівфабрикатів в об'ємі 15-30 л. Напівфабрикат освітлюють шляхом центрифугування в сепараторі.
Вакцину інактивують в іррадіаторі ультрафіолетового проміння, який є закритою камерою, що містить зверху 4 підвішені БУВ-30П і під ними - скляний диск, що обертається. В Інституті поліомієліту і вірусного енцефаліту АМН СРСР використовується диск з нержавіючої сталі. Вірус по закритій системі трубок подається на диск, що обертається, і по відцентровій силі розподіляється на ньому тонким шаром (менше 1 мм); у цей же час відбувається опромінювання вірусовмісного матеріалу. Опромінений препарат стікає на зовнішню поверхню диска і звідти по трубках поступає в стерильний бутиль.
Перед розливом в напівфабрикат вакцини додають 10% розчин желатози і 75% розчин сахарози, стерилізовані автоклавуванням. Кінцева концентрація желатози і сахарози у вакцині складає відповідно 1 і 7,5 %. На потоковій автоматичній лінії «Strank Со» вакцину розливають у флакони з нейтрального скла по 3 мл і заморожують при температурі від -60 до -65°С. Після 6 год. їх переносять у вакуум-сушильну камеру. Ліофілізацію проводять при температурі 34-З6°С протягом 23-30 год. та при температурі 20-24°С протягом подальших 8-14 год. в режимі автоматики. Флакони наповнюють аргоном, закривають спеціальними гумовими пробками і закатують алюмінієвими ковпачками. На кожний флакон з вакциною наносять назву препарату, номер серії, контрольний номер, термін придатності.
Вимоги до виробничих приміщень. Для забезпечення виробництва антирабічної вакцини необхідні приміщення для карантину тварин, віварій для утримання, зараження і обробки овець, спеціальні лабораторні приміщення для виготовлення напівфабрикату вакцини, розливу, ліофілізації і фасування. Останні три технологічні етапи можуть здійснюватися централізовано у відповідних відділеннях.
4.ЖИВА ДЕРМАЛЬНА ВІСПЯНА ВАКЦИНА (СУХА)
Жива суха дермалъна віспяна вакцина (Vaccinum variolare siccum) застосовується для профілактичних щеплень проти віспи людини шляхом нашкірної аплікації або внутрішньошкірного введення за допомогою безголкового ін'єктора. Готується з вірусу, вирощеного в основному на телятах, вівцях або буйволах. Останнім часом для приготування вакцини у нашій країні використовують тільки вірус, вирощений на шкірі телят. Вірус висушують під вакуумом із замороженого стану в ампулах або флаконах по 10-20 доз (0,1-0,2 мл) в присутності 5-10% пептону. Вакцина, має вигляд однорідної пористої маси білого, сіруватого або жовтуватого кольору. Після додавання відповідної кількості розчинника (0,1-0,2 мл) вакцина набуває вигляд злегка жовтуватої рідини без комків і осаду. Розчинник – 50% гліцерин.
У даний час використовують 3 виробничі вірусні штами, кожний з яких проводять по власних схемах: штам білоруського ІЕМ (послідовні пасажі на шкірі телят), штам ЕМ-63 (п'ять послідовних пасажів на шкірі телят), Л-ІВП (один проміжний пасаж початкової вакцини на шкірі кролика і 5 послідовних пасажів на шкірі телят). Кожний з штамів і кожна схема їх пасирування мають як позитивні, так і негативні сторони.
Подальше удосконалення препарату включало опрацювання способів максимального очищення вірусовмісної рідини від супутньої бактерійної флори і стабілізацію основних властивостей вакцини за рахунок ліофілізації матеріалу. Для очищення вакцини від бактерій застосовувалися фізичні методи (теплова обробка, центрифугування), біологічні (бактеріофагія, антибіотики і хімічні речовини, що вбивають мікрофлору, але в певних концентраціях слабко діючі на вірус. Останніми роками найбільш широке застосування знайшло поєднання хімічного і фізичного очищення (фенол в різних концентраціях при певних температурах, обробка фреоном 113 і центрифугування, що відділяє значну частину бактерій від вірусу).
Технологія отримання вірусу. Для отримання вірусу вакцини використовують молодняк великої рогатої худоби у віці від 6міс до 2 років. Тварини можуть бути тільки з господарств, благополучних за інфекційними захворюваннями. Перед використанням у виробництві телята повинні пройти 30-денний карантин. Кожну партію телят тримають в окремих секціях карантинного телятника. Окрім систематичного огляду, щоденної термометрії, під час карантину проводять обстеження тварин.
Перед зараженням телят ретельно миють теплою водою з милом, виголюють весь шкірний покрив, промивають теплою водою і обробляють 70о спиртом. В операційній проводять скарифікацію всієї поверхні тіла (окрім ніг і голови), в поздовжньому і поперечному напрямках. На скарифіковану поверхню наносять посівний матеріал з гліцерином і ретельно втирають його. Титр посівного вірусу повинен бути не нижчим 1∙10-9 ООЕ/мл (віспоутворюючі одиниці). Заражене теля знаходиться в клініці протягом 80-96 год., під постійним наглядом. Після забою шкіру теляти миють водою з милом і відділяють шматками.
Процес приготування вакцини можна проводити за трьома технологічними варіантами: із замочуванням шкіри з віспинами в 1,5% розчині фенолу при кімнатній температурі протягом 4 год. (варіант А), без замочування, але з додаванням 0,4-0,5% фенолу у вірусовмісну суспензію (варіант Б) і шляхом комбінації цих двох методів (варіант В). З шматків шкіри спеціальною ложкою зішкрібають віспяний детрит і зберігають його при температурі вищій -35°С. Заздалегідь беруть пробу для контрольних дослідів.
Приготування вакцини. Варіант А. Для отримання однорідних і стандартних по властивостях серій вакцини рекомендується готувати суміш з декількох зішкребів віспин, одержаних від телят, щеплених однією серією посівного вірусу. Зішкреби подрібнюють на млині або в апаратах у стерильних умовах. Подрібнення зберігають при 4°С. Для обробки подрібненого зішкребу фреоном 113 використовують високошвидкісні гомогенизатори.
Після гомогенізації суміш центрифугують при 2000-2400 об/хв. протягом 10 хв. Повторне центрифугування проводять протягом 10-20 хв. На кожному етапі обробки зішкребу беруть проби на бактеріологічну стерильність і активність.
Після проведення вказаних вище контрольних дослідів вірусовмісну рідину з’єднують із стерильним пептоном (до 5 -10%), розливають по ампулах або флаконах і заморожують при температурі не вище -35°С на протязі 18 - 96 год.
Процес ліофілізації (висушування із замороженого стану) проводять в умовах, що забезпечують збереження його бактеріологічної стерильності.
Термін придатності вакцини, що зберігається при температурі не більше 10°С, 2 роки з моменту виготовлення (висушування), при 2°С - 6 міс, при,37°С - 1 міс.
5.Вимоги до техніки безпеки і режиму виробничих лабораторій. При роботі з вірусом необхідно захищати очі окулярами. За наявності на руках подряпин або інших пошкоджень необхідно надягати гумові рукавички.
Приміщення для виробництва віспяної вакцини повинні бути ізольовані від відділів, де проводяться роботи з іншими інфекційними матеріалами, а також від віварію і карантинного господарства. У виробничі приміщення забороняється вносити інші віруси або інші штами вірусу вісповакцини.
Режим прибирання в приміщеннях звичайний. У боксі, де проводиться робота з фреоном 113, привідна і витяжна вентиляція повинна бути більш активною, ніж в звичайних боксах (приблизно, в 2 рази).
Залишки вірусного матеріалу на етапах очищення і контролю знищують шляхом автоклавуання при 1,1 атм. протягом 2 год.
Всі поступаючі на роботу співробітники повинні бути вакциновані проти віспи і пройти інструктаж по техніці безпеки. Співробітники лабораторії повинні не рідше одного разу на рік проходити медичний огляд. Люди, які страждають хронічною коковою інфекцією, відкритою формою туберкульозу, шкірними захворюваннями, гострою формою респіраторних і кишкових захворювань, до роботи з вакциною не допускаються.
