Схема РГГА для серологічної діагностики грипу

Реакція вважається позитивною при утворенні компактного, щільного осаду еритроцитів з рівними краями.

Експрес-діагностика. Метод базується на виявленні в досліджуваному матеріалі специфічних вірусних антигенів за допомогою імунофлуоресценції в прямій або непрямій РІФ. Слиз отримують із носових ходів або задньої стінки глотки, центрифугують і з осаду клітин циліндричного епітелію слизової оболонки готують мазки на предметних скельцях. Їх обробляють імунофлуоресцентними сироватками, кон’югованими з флуорохромами, наприклад, ФІТЦ (флуоресцеїнізоті­оцианат). При дослідженні препаратів за допомогою люмінесцентного мікроскопа спостерігають характерне зелено-жовтувате світіння вірусів грипу, які локалізуються на початку хвороби в ядрах епітеліальних клітин.

Останнім часом пропонується використовувати для індикації специфічних вірусних антигенів ІФА, РЗНГА, ПЛР.

Парагрип

Віруси парагрипу за формою та ультраструктурою подібні до грипозних, але значно більші за розмірами. Діаметр сферичних форм – 150-300 нм. Зустрічаються також грушеподібні й гіллясті форми. Віруси містять однониткову лінійну нефрагментовану “мінус” нитку РНК. Суперкапсидна оболонка має гемаглютинін і нейрамінідазу. Віруси містять 6-8 структурних білків, серед яких білки нуклеокапсиду – HN, P, L. Особливий білок М локалізується між нуклеокапсидом і суперкапсидною оболонкою.

Віруси здатні аглютинувати еритроцити гвінейських свинок, курей, мавп і людини. Культивуються в перещеплюваних і первинних культурах клітин людини й мавп (HeLa, BHK-21, Vero, HЕp-2, СМЦ), але погано розвиваються в курячих ембріонах. За антигенною будовою розрізняють 5 серотипів, які спричиняють різні респіраторні захворювання: гострі фарингіти, ларингіти, трахеобронхіти, пневмонію, круп. Особливо тяжкий перебіг захворювань у дітей першого року життя.

Для вірусологічної діагностики парагрипозної інфекції досліджують слиз із задньої стінки глотки, нижніх носових ходів, автопсійний матеріал (тканини трахеї, бронхів, легень). Як правило, матеріал забирають у перші дні хвороби, що пов’язано з високою концентрацією віріонів у ньому. Забір проводять одночасно за допомогою 2-3 стерильних ватних тампонів, які пізніше занурюють в одну пробірку з 5 мл розчину Хенкса та 5 % бичачого сироваткового альбуміну або грітої бичачої сироватки крові. Перед наступним виділенням вірусів тампони віджимають і видаляють з пробірки, і після відстоювання відбирають середню порцію рідини для подальшого дослідження. Присутню мікрофлору знищують додаванням по 500 ОД/мл пеніциліну і стрептоміцину, виримуючи пробірки протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, і заражають моношари культур клітин. Матері­ал, який залишився, зберігають певний час при температурі -18 °С для повторного, у разі потреби, дослідження.

Довести наявність вірусів у культурах клітин можна через 2-4 дні за цитопатичною дією. При цьому спостерігається утворення симпластів з численними ядрами, заокруглені контури клітин, культура набуває вигляду твердого сиру (ділянки відсутності клітин). З цією метою також широко використовується реакція гемадсорбції (РГ_адс.), яку ставлять з еритроцитами гвінейських свинок. Починаючи з 6-8 дня культивування вірусів для індикації їх в культурі клітин можна використати РГА з еритроцитами гвінейських свинок.

Для типування парагрипозних вірусів використовують РН, РГГА, РЗК, РГГ_адс та інші. У реакції гальмування гемаглютинації використовують 0,7 % завись еритроцитів гвінейських свинок або людини. Слід звернути увагу, що чутливість реакції підвищується, якщо систему „вірусмісткий матеріал – противірусна діагностична сироватка” інкубувати при кімнатній температурі протягом 2 год або 18 год при 4 °С. Після додавання відповідних еритроцитів реакцію ще витримують при 22 °С протягом 1 год і оцінюють результати. Оскільки різні серотипи вірусів парагрипу мають спільні антигени імунологічні реакції ставлять, попередньо зробивши розведення діагностичних сироваток. Серологічний тип вірусу ­визначають за найбільшим титром діагностичної сироватки, яка дала позитивний результат.

Значного поширення набула для ідентифікації вірусів парагрипу РН, в якій результати оцінюють за гемадсорбцією. При її постановці спочатку витримують суміш інактивованих прогріванням при 56 °С 30 хв типоспецифічних діагностичних сироваток з виділеним вірусом протягом 2 год при кімнатній температурі. Потім заражають культури клітин, інкубуючи їх при 35 °С 4-5 днів, і додають завись еритроцитів гвінейських свинок. Після інкубації протягом 20 хв при температурі 37 °С читають результати. При нейтралізації сироваткою вірусів парагрипу не спостерігається адсорбції еритроцитів на поверхні клітин.

Серологічна діагностика проводиться з парними сироватками хворого, які одержують відповідно на початку захворювання і двома тижнями пізніше. Протягом цього часу першу сироватку зберігають у холодильнику в замороженому стані. Чотирикратний приріст титру антитіл визначають паралельно у двох рядах пробірок, використовуючи стандартні методики постановки РГГА і РЗК.

Експрес-діагностика є достатньо інформативним методом, який дозволяє визначити віруси в досліджуваному матеріалі. З цією метою частину матеріалу, який було отримано для вірусологічної діагностики, центрифугують 5-7 хв при 1000 об/хв. Отриманий осад ресуспензують у 3-5 краплях надосадової рідини і готують з нього мазки. Їх обробляють імунофлуоресцентними сироватками і до­сліджують у люмінесцентному мікроскопі.

Спостерігаються циліндричні або полігональні клітини і заокругленої форми лейкоцити. За умови наявності вірусів у клітинах з’являється характерне зелене світіння цитоплазми окремих клітин, у той час як клітини, що не містять вірусів, мають цегляно-червоний колір. Оцінити достовірність результатів дозволяє вивчення контрольних препаратів.

До супернатанту, що залишився, додають пеніцилін і стрептоміцин в концентрації 500 ОД/мл. Через 30 хв інкубації при температурі 18-20 °С матеріалом заражають культури клітин, які вирощуються заздалегідь на стерильних предметних скельцях, вміщених у пробірки. Культивують віруси у такому стані 24-72 год при температурі 35 °С, а потім скельця з культурою клітин промивають стерильним буферним розчином і висушують. Для фіксування використовують охолоджений до -20 °С ацетон (10-20 хв при кімнатній температурі), пізніше скельця висушують і обробляють специфічними імунофлуоресцентними сироватками (пряма або непряма реакція імунофлуоресценції).

Визначити незначну кількість вірусів у будь-якому досліджуваному матеріалі можна, використовуючи методи генетичної діагностики, і, зокрема, полімеразну ланцюгову реакцію.

Кір

Зрілий віріон кору має овальну форму діаметром 120-250 нм. У середині містить однониткову “мінус”-нитку несегментованої РНК. Суперкапсидна оболонка має вирости (шипики). Вірусні структурні компоненти представлено гема­глютиніном, F1- і F2-білками, нуклеокапсидним та М-протеїном, а також білком полімеразного комплексу. На відміну від інших парамікосвірусів, не містить нейрамінідази, однак має гемаглютинін, який спричиняє аглютинацію еритроцитів мавп. Репродукується в первинно-трипсинізованих культурах клітин ниркового епітелію, HeLа, HЕp-2, Vero, погано культивується в курячих ембріонах. У культурах клітин викликає цитопатич­ну дію у вигляді симпластів. Існує лише один антигенний тип вірусу. Він нестійкий до дії факторів зовнішнього середовища, при кімнатній температурі гине через кілька годин, але вірулентність втрачає через 30 хв. Чутливий до дії високих температур, ультрафіолетового опромінення, ­добре зберігається в замороженому стані.

Вірусологічна діагностика. Найчастіше кір діагностують на підставі клінічної симптоматики, спостерігаючи етапи появи висипань, появу плям Бельського-Філатова-Копліка на слизовій оболонці щік тощо.

Лабораторна діагностика проводиться рідко. Методи виділення та ідентифікації вірусів у звичайній лабораторній практиці не застосовують, хоча знайти вірус у досліджуваному матеріалі можна за 2-3 дні до появи висипань. Проте, як досліджуваний матеріал для виділення вірусів, можуть бути використані змиви з носової частини глотки, виділення з кон’юнктиви, сеча, кров, спинномозкова рідина, а також секційний матеріал. Після відповідної підготовки (додавання пеніциліну і стрептоміцину, в разі потреби центрифугування тощо) матеріалом заражають первинно-трипсинізовані культури клітин ембріона людини, нирок мавп або перещеплювані лінії Hela, HЕp-2 та інші. Культури клітин підлягають спостереженню протягом 30 діб. Одним з критеріїв наявності вірусів у матеріалі є поява цитопатичної дії, що проявляється утворенням синцитіїв і злиттям клітин. Типувати віруси можна, використовуючи метод імунофлуоресценції, РГГ_адс, РН у культурі клітин за феноменом гемадсорбції, ІФА.

Серологічна діагностика кору використовується в лабораторній практиці значно частіше. Дослідженню підлягають парні сироватки хворих. Віруснейтралі­зуючі, антигемаглютинуючі та комплементзв’язуючі антитіла виявляють в крові досить рано. Часто вони досягають високих титрів разом з появою висипань. Першу сироватку беруть у перші дні захворювання, другу – через 12-14 днів. Ставлять реакції паралельно в двох рядах пробірок.

Для спостереження за динамікою зростання титру антитіл використовують РН, РГГА, РНГА, РЗК. Для постановки РГГА використовують еритроцити приматів. РНГА є однією з найдоступніших у лабораторній практиці. Позитивними вважають ті реакції, які довели чотирикратне зростання титру антитіл.

Експрес-діагностика. Як і при більшості інших вірусних захворювань, метод флуоресцуючих антитіл дозволяє швидко визначити вірус в епітеліальних клі­тинах носоглоткових змивів, осаді сечі, лейкоцитах крові, секційному матеріалі (мозок) тощо. Антигени, що локалізуються в цитоплазмі, світяться в ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа при обробці специфічними сироватками, міченими флуорохромами.

Полімеразна ланцюгова реакція надає можливість швидко визначити нуклеїнову кислоту віріонів кору безпосередньо в досліджуваному матеріалі.