ТЕМА: В-ЛИМФОЦИТЫ. ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ.
ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ
1. В-лимфоциты: развитие, маркеры. В-клеточный рецептор: структура (константные и вариабельные участки, полипептидные цепи). Механизмы В-клеточной активации. Функция В-лимфоцитов.
1. Антитела. Структура молекулы иммуноглобулинов: вариабельные и константные области, расположение и структура доменов. Антигенсвязывающие участки.
2. Антителогенез, динамика синтеза антител. Поликлональные и моноклональные антитела
3. Классы и субклассы иммуноглобулинов, изотипы, аллотипы, идиотипы. Биологические свойства иммуноглобулинов
4. Механизм взаимодействия антител с антигенами. Валентность, аффинность и авидность антител. Перекрестные реакции. Полные и неполные антитела. Иммунные комплексы.
5. Биологические эффекты взаимодействия антител с антигенами: активация комплемента, нейтрализация токсинов и вирусов, лизис, агглютинация и опсонизация микроорганизмов, торможение адгезии, инвазии, подавления фагоцитарной реакции.
6. Прямая и непрямая реакция Кумбса.
7. Простая радиальная иммунодиффузия в агаре по Манчини.
ЛАБОРАТОРНАЯ И САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА
1. Изучить структурную организацию молекул иммуноглобулинов:
| Отметьте на рисунке: 1 – H-цепь 2 – L-цепь 3 - Шарнирный участок 4 – Fab-фрагмент 5 – Fc-фрагмент 6 – Вариабельный домен легкой цепи 7 – Константный домен легкой цепи 8 – Эпитоп 9 – Паратоп (активный центр) 10 - Вариабельный домен тяжелой цепи 11 – Константные домены тяжелой цепи Валентность данного Ig = 2 |
| |||||
| 1 – IgG, | 2 – IgM | 3 – IgA | 4 – s IgA | 5 – IgD | 6 – IgE |
Отметьте на рисунке:
Характеристика иммуноглобулинов
| Класс Ig | Концентрация в крови г/л | Характеристика |
| IgG | Молекулярная масса 154 кДа. 85% всех иммуноглобулинов. Четыре субкласса. Мономер. Проникает через плаценту. Высокоэффективны в противоинфекционной защите. | |
| Ig M | Молекулярная масса 900 кДа. 5-10% всех иммуноглобулинов. Пентамер. Образуются преимущественно при первичном иммунном ответе. | |
| IgA | 2,5 | Молекулярная масса 160 кДа. 5-15% всех иммуноглобулинов. Два субкласса. Мономерные, димерные, тримерные. Сывороточный является мономером, а секреторный ди- или триммером. Секреторный выделяется на поверхность слизистой, обеспечивая местный иммунитет. |
| IgE | 0,00025 | Молекулярная масса 190 кДа. ‹ 1% всех иммуноглобулинов. Мономер. Высокая цитофильность. Участвуют в аллергических реакциях немедленного типа. |
| IgD | 0,03 | Молекулярная масса 185 кДа. 1% всех иммуноглобулинов. Мономер. Экспрессируются в основном на мембране В-лимфоцитов, участвуют в их дифференцировке, выполняют рецепторную функцию. |
2. Схемы прямой и непрямой реакции Кумбса (нарисуйте)
Прямая реакция Кумбса позволяет выявить неполные антитела, фиксированные на эритроцитах. К капле антиглобулиновой сыворотки (АГС), полученной иммунизацией кроликов глобулинами человека, прибавляют взвесь эритроцитов крови исследуемого человека, отмытых от плазмы. Результат учитывают через 5-15 мин.
Непрямая реакция Кумбса основана на способности неполных антител фиксироваться на нормальных эритроцитах при инкубации их в термостате с сывороткой исследуемого. К исследуемой сыворотке прибавляют взвесь отмытых от плазмы эритроцитов здорового человека 0-группы крови (эритроцитарного диагностикума). Смесь ставят в термостат. Затем реакция ставится так же, как и прямая.
| Схема прямой реакции Кумбса | Схема непрямой реакции Кумбса |
| 
|
етод оценки В-системы.
►Количественная оценка.
Определение количества В-лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами мыши.
Принцип метода: На 1 этапе из крови выделяют лимфоциты. На 2 этапе с помощью реакции розеткообразования с эритроцитами мыши определяют процент В-лимфоцитов от общего числа лимфоцитов. При добавлении к суспензии лимфоцитов эритроцитов мыши, последние адсорбируются В-лимфоцитами, а образующиеся при этом структуры называются розетками. Общее количество лимфоцитов подсчитывают под микроскопом по количеству розеток.
| ПрепаратКровь обследуемого пациента в количестве 10 мл вносят в пробирку с раствором гепарина и осторожно наслаивают на смесь фиколл-гипака, который способствует выделению лимфоцитов, и центрифугируют. После центрифугирования эритроциты оседают на дно пробирки, а лимфоциты располагаются тонким слоем на границе раствора фиколл-гипака и плазмы. Взвесь лимфоцитов осторожно извлекают из этого слоя (интерфазы), доводят до концентрации 2–4x106/мл (2–4x109/л) и смешивают с взвесью эритроцитов барана в соотношении 1:1. Полученную смесь инкубируют при 37°С в течении 10 минут и снова центрифугируют, после чего выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С в течение нескольких часов. Подсчет клеток производят в камере Горяева при люминесцентной микроскопии. Подсчитывают число “розеток” на 100 лимфоцитов и определяют процентное содержание Т-лимфоцитов. Для определения абсолютного количества Т-лимфоцитов в день исследования производят общий клинический анализ крови. В норме содержание Т-лимфоцитов в периферической крови колеблется от 50 до 70% от общего количества лимфоцитов (в среднем 54,3±1,0%). Окраскапо Романовскому Увеличение900 Метод выявляет маркер CD 20 на поверхности В-лимфоцитов; Содержание В-лимфоцитов – (CD 20) = 8-20% от общего числа лимфоцитов. |
►Качественная (функциональная) оценка
Определение концентрации иммуноглобулинов G класса в сыворотке крови методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини (в реакции преципитации).
Принцип метода: На стеклянную пластинку (или чашку Петри) наливают агар, смешанный с антителами против IgG. После застывания в агаре делают лунки диаметром 2 мм. В один ряд лунок вносят разведения стандартной сыворотки с известной концентрацией IgG. В другие лунки добавляют исследуемые сыворотки крови больных. Иммуноглобулины диффундируют в агар и на месте встречи с антителами, которые находятся в агаре, образуется зона кольца преципитации. Диаметр этого кольца зависит от концентрации Ig (чем больше Ig, тем больше диаметр). Измеряют диаметр зоны преципитации для трех разведений стандартной сыворотки и по ней на полулогарифмической бумаге строят график зависимости квадрата диаметра кольца преципитации (Д) от количества Ig в сыворотке крови. Затем измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки, наносят на построенный график и определяют концентрацию Ig. Стандарт IgG = 10-20 г/л.
| 
|
Заключение __________________
_____________________________
_____________________________
Реакция Кумбса - это антиглобулиновый тест для определения неполных антиэритроцитарных антител. Используется для выявления антител к резус-фактору у беременных женщин и определения гемолитической анемии у новорождённых детей с резус-несовместимостью, влекущей разрушение эритроцитов. Данный метод был предложен английским врачом Робертом Кумбсом в 1945 году, в связи с чем впоследствии получил название "реакция Кумбса".
Антиглобулиновая сыворотка - реагент, необходимый для проведения теста Кумбса. В состав антиглобулиновой сыворотки входят антитела к иммуноглобулинам человека. Сыворотка взаимодействует с эритроцитами, сенсибилизированными неполными антителами, что приводит к их агглютинации.
Прямая и непрямая реакции Кумбса
Антитела, находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть как в статичном, так и в свободном состоянии в плазме крови. Положительна при:
- аутоиммунном гемолизе;
- гемолитической болезни новорожденных;
- лекарственной иммунной гемолитической анемии;
- гемолитических трансфузионных реакциях.
Антирезус-антитела образуются у 3-5 % женщин с резус-отрицательной кровью при беременности плодом с резус-положительной кровью. Обычно дети при резус-конфликте рождаются с ГБН от 2-3-й беременности, реже от 1-й беременности в случаях сенсибилизации в прошлом переливаниями крови без учета резус-фактора. У некоторых женщин количество антител может быть незначительно и антитела не проникают через плаценту, при этом у резус-сенсибилизированной женщины может родиться здоровый резус-положительный ребенок после рождения ею детей, страдавших ГБН. При АВО-несовместимости заболевание развивается уже при 1-й беременности.
акономерности наследования группы крови и резус-фактора.
Наследование группы крови контролируется аутосомным геном. Локус этого гена обозначают буквой I, а три его аллеля буквами А, В и 0. Аллели А и В доминантны в одинаковой степени, а аллель 0 рецессивен по отношению к ним обоим. Существует четыре группы крови. Им соответствуют следующие генотипы:
Первая (I) 00 Вторая (II) АА; А0 Третья (III) ВВ; В0 Четвертая (IV) АВ
Пример 1:
жена имеет первую группу крови (00)
муж имеет вторую группу крови и является гомозиготой (АА)
жена 00 + муж АА
гаметы: 0 0 А А
ребенок: А0 А0 А0 А0
Все дети имеют вторую группу крови и являются гетерозиготами по данному признаку.
Пример 2:
жена имеет первую группу крови (00)
муж имеет вторую группу крови и является гетерозиготой (А0)
жена 00 + муж А0
гаметы: 0 0 А 0
ребенок: А0 А0 00 00
В данной семье в 50% возможно рождение ребенка, имеющего вторую группу крови, и в 50% группа крови ребенка окажется первой.
Наследование резус-фактора кодируется тремя парами генов и происходит независимо от наследования группы крови. Наиболее значимый ген обозначается латинской буквой D. Он может быть доминантным - D, либо рецессивным - d. Генотип резус-положительного человека может быть гомозиготным - DD, либо гетерозиготным - Dd. Генотип резус-отрицательного человека может быть - dd.
Пример 1: жена имеет отрицательный резус-фактор (dd)
муж имеет положительный резус-фактор и является гетерозиготой(Dd)
жена dd + муж Dd
гаметы: d d D d
ребенок: Dd Dd dd dd
В данной семье вероятность рождения резус-положительного ребенка составляет 50% и вероятность рождения резус-отрицательного ребенка также составляет 50%.
Пример 2:
жена имеет отрицательный резус-фактор (dd)
муж имеет положительный резус-фактор и является гомозиготой по данному признаку (DD)
жена dd + муж DD
гаметы: d d D D
ребенок: Dd Dd Dd Dd
В данной семье вероятность рождения резус-положительного ребенка составляет 100%.
Особенности течения беременности при несовместимости по резус-фактору. Резус-конфликт.
Гемолитическая болезнь плода и новорожденного это состояние, возникающее в результате несовместимости крови матери и плода по некоторым антигенам. Наиболее часто гемолитическая болезнь новорожденного развивается вследствие резус-конфликта. При этом у беременной женщины резус-отрицательная кровь, а у плода резус-положительная. Во время беременности резус-фактор с эритроцитами резус-положительного плода попадает в кровь резус-отрицательной матери и вызывает в ее крови образование антител к резус-фактору (безвредных для нее, но вызывающих разрушение эритроцитов плода). Распад эритроцитов приводит к повреждению печени, почек, головного мозга плода, развитию гемолитической болезни плода и новорожденного. В большинстве случаев заболевание быстро развивается после рождения, чему способствует поступление большого количества антител в кровь ребенка при нарушении целостности сосудов плаценты.
Реже гемолитическая болезнь новорожденного вызывается групповой несовместимостью крови матери и плода (по системе АВ0). При этом за счет агглютиногена (А или В), имеющегося в эритроцитах плода, но отсутствующего у матери, в материнской крови происходит образование антител к эритроцитам плода. Чаще иммунная несовместимость проявляется при наличии у матери I группы крови, а у плода - II, реже III группы крови.
Процесс иммунизации беременной женщины начинается с момента образования антигенов в эритроцитах плода. Поскольку антигены системы резус содержаться в крови плода с 9-10й недели беременности, а групповые антигены - с 5-6й недели, то в некоторых случаях возможна ранняя сенсибилизация организма матери. Проникновению антигенов в материнский кровоток способствуют инфекционные факторы, повышающие проницаемость плаценты, мелкие травмы, кровоизлияния и другие повреждения плаценты. Как правило, первая беременность у резус-отрицательной женщины при отсутствии в прошлом сенсибилизации организма протекает без осложнений. Сенсибилизация организма резус-отрицательной женщины возможна при переливаниях несовместимой крови (проводимых даже в раннем детском возрасте), при беременностях и родах (если у плода резус-положительная кровь), после абортов, выкидышей, операций по поводу внематочной беременности. По данным литературы после первой беременности иммунизация возникает у 10% женщин. Если женщина с резус-отрицательной кровью избежала резус-иммунизации после первой беременности, то при последующей беременности резус-положительным плодом вероятность иммунизации вновь составляет 10%. Поэтому после любого прерывания беременности у женщины с резус-отрицательной кровью с профилактической целью необходимо введение антирезус-иммуноглобулина. В течении беременности у женщины с резус-отрицательной кровью обязательно необходимо определение титра резус-антител в крови в динамике.
Если антитела зафиксированы на поверхности эритроцитов, проводится прямой тест Кумбса. В этом случае тест проходит в один этап - добавляется антиглобулиновая сыворотка. Если на поверхности эритроцитов присутствуют неполные антитела, происходит агглютинация эритроцитов
Непрямая реакция Кумбса протекает в 2 этапа. Сначала необходимо искусственно осуществить сенсибилизацию эритроцитов. Для этого эритроциты и исследуемую сыворотку крови инкубируют, что вызывает фиксацию антител на поверхности эритроцитов. После чего проводится второй этап теста Кумбса - добавление антиглобулиновой сыворотки.
Применение антиглобулиновой сыворотки
Реакция Кумбса относится к основным изосерологическим исследованиям. Непрямой тест Кумбса необходимо проводить перед трансфузией в целях определения совместимости реципиента и донора, а также для дополнительного обеспечения безопасности реципиента. Также антиглобулиновая сыворотка используется для определения резус-принадлежности, обнаружения иммунных антител системы АВ0 и аллоиммунных антиэритроцитарных антител при гемолитических осложнениях, определения слабых эритроцитарных антигенов.
Помимо трансфузиологов к диагностике с помощью антиглобулинового теста прибегают специалисты таких областей как генетика, гематология, акушерство, судебная медицина и других.
