пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента.

пределение влияния pH на работу фермента.

Опыт проводили в двух повторностях. К 0,4 мл раствора сахарозы (концентрация 2x10^-2 M) добавляли 0,1 мл разведённого в 5000 раз раствора фермента в буфере с различным pH (3,2 – 7,2). В течение 9 минут проводили инкубацию при температуре 30^oC. Поcле проведения гидролиза добавляли 2 мл раствора ДНСК и ставили пробирку на кипящую водяную баню на 15 минут. Растворы охлаждали, добавляли 7,5 мл дистиллированной воды и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при λ = 470 нм.

pH раствора фермента	3,2	4,2	5,2	6,2	7,2
D470 средн.	0,120	0,314 ± 0,001	0,339 ± 0,038	0,334 ± 0,002	0,095 ± 0,035

 

Определение термостабильности фермента инвертаза.

Определение проводили в трёх повторностях. В отличии от предыдущих опытов, pH гидролиза был оптимальным – 5,2. Концентрация субстрата - 3x10^-2 M. Раствор фермента изначально был прогрет до 35-65 градусов с интервалом в 5^oC. Определение концентрации продуктов проводили аналогично. Результаты приведены в таблице и графике.

Темп. предварит. прогрева	1-я проба	2-я проба	3-я проба	Среднее значение
Без прогрева	0,387	0,381	0,342	0,370 ± 0,024
35oC	0,337	0,348	0,293	0,326 ± 0,029
40oC	0,438	0,363	0,341	0,353 ± 0,016
45oC	0,243	0,248	0,252	0,248 ± 0,005
50oC	0,324	0,339	0,333	0,332 ± 0,008
55oC	0,277	0,289	0,325	0,297 ± 0,025
60oC	0,130	0,130	0,158	0,139 ± 0,016
65oC	0,014	0,000	0,000	0,005 ± 0,008

 

пределение удельной активности фермента.

Удельная активность фермента рассчитывается как отношение вступившего в реакцию субстрата на единицу времени и единицу массы фермента.

Для расчётов была выбрана точка 9` при концентрации субстрата 0,01М в первом опыте. В результате гидролиза образовалось 489,2 мкг альдаровых кислот (молярная масса – 210 г/моль) в 1 мл раствора или 2,33 μмоль/мл. Из 1 моля сахарозы образуется 2 моль альдаровых кислот. Следовательно, в реакцию вступило 1,16 μмоль/мл сахарозы.

Для определения массы фермента использовался метод Лоури.

Опыт проводили в двух повторностях. К 1 мл разведённого в 20 раз фермента добавили 5 мл «реактива С», провели инкубацию в течение 10 минут, добавили 0,5 мл реактива Фолина и оставили при комнатной температуре на 30 минут. При λ=750нм определяли оптическую плотность. Концентрацию белка расчитывали по калибровочной кривой (см. приложение), построенной по стандартным растворам белка. Уравнение кривой – y=0,0018x

Среднее значение оптической плотности составило 0,279 оптических единиц, что составляет 155 мкг белка в мл раствора белка 1:20. Соответственно, в растворе 1:5000 содержится 6,2x10^-4 мг/мл фермента.

Итого, удельная активность фермента: .

 

пределение константы Михаэлиса и максимальной скорости работы фермента.

Для вычисления константы Михаэлиса были проведены ферментативные реакции гидролиза сахарозы в концентрациях от 0,01 до 0,05 моль/л (в трёх повторностях каждой концентрации). Концентрации продуктов были определены по методу ДНСК аналогично предыдущим опытам.

Результаты определения и расчитанные параметры приведены в таблице.

[S], M	D470(1)	D470(2)	D470(3)	D470 av.	∆S, M	V,mol/l*min	E, μmol/(min*mg)	1/V	1/S	V/S
0,008	0,359	0,430	0,351	0,380	1,392E-03	1,988E-04	320,72	5028,95	125,00	0,0249
0,016	0,634	0,652	0,650	0,645	2,364E-03	3,377E-04	544,67	2961,26	62,50	0,0211
0,024	0,819	0,790	0,850	0,820	3,002E-03	4,289E-04	691,81	2331,44	41,67	0,0179
0,032	0,999	0,999	1,010	1,003	3,673E-03	5,247E-04	846,26	1905,92	31,25	0,0164
0,04	1,120	1,095	1,021	1,079	3,951E-03	5,645E-04	910,41	1771,63	25,00	0,0141

 

График зависимости скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата, как и предполагалось, имеет вид логарифмической кривой.

 

Далее, с помощью графика в двойных обратных координатах и графика Иди-Хофсти (см. приложение) были определены константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции.

K_m = 0,035 моль/л, V_max = 0,0011 моль/(мин*л).

Выводы

1. В процессе выполнения работы было определено оптимальное время инкубации фермента с субстратом – 7 минут, оптимальная концентрация субстрата – 0,02 моль/л.

2. Оптимальный pH для работы фермента – 5,2.

3. Изучение термостабильности показало значительное падение активности фермента после прогревания при температуре cвыше 55^oC.

4. Константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции были определены на уровне 0,035 моль/л и 0,0011 моль/(мин*л) соответственно.

Приложение