одготовка пробы биологического материала.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 20

ТЕМА: «МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ»

I План занятия

1. Изучить принцип метода амплификации нуклеиновых кислот.

2. Изучить принцип методов детекции фрагментов ДНК возбудителей.

3. Изучить принцип метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот.

II Самостоятельная работа

Задание 1.

Изучите принцип метода амплификации нуклеиновых кислот.

ПЦР – метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаруживать единственную специфическую ДНК в присутствии миллиона других молекул.

Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последнее десятилетие. Суть метода заключается в многократном копировании в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. Изолированное умножение гена или его фрагмента называют амплификацией, которая является одним из способов выживания микроорганизмов и клеток животных, например, в условиях действия противоопухолевых и противобактериальных препаратов.

Амплификация – основа ПЦР метода. На каждом цикле амплификации, синтезированные ранее фрагменты, вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК в миллиарды раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Таким образом, ПЦР позволяет осуществлять амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы из 4 дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), являющихся структурными элементами всякой ДНК, и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3'-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК.

Каждый цикл синтеза (амплификации) состоит из 3 этапов, протекающих в различных температурных режимах.

1-ый этап. Денатурация ДНК – расплетение двойной спирали при температуре 93-95^оС в течение 30-40 сек.

Одна из цепей (+) используется в качестве основной матрицы. Ее 5’-конец фиксируется ферментом ДНК-полимеразой, что обеспечивает построение из отдельных нуклеотидов второй цепи ДНК, комплементарной первой. То же самое, только в обратном направлении, происходит и на второй нити ДНК, однако, так как расплетение молекул ДНК идет в обратном направлении, то новая цепь строится небольшими фрагментами, которые затем сшиваются. Для того, чтобы фермент ДНК-полимераза начал свою работу, требуется наличие затравки или праймера – небольшого одноцепочечного фрашмента ДНК, который, соединяясь с комплементарным участком одной из родительской ДНК, образуя стартовый блок для наращивания дочерней нити.

2-ой этап. Отжиг – присоединение праймеров при температуре 50-65^оС в течение 20-60 сек. Праймеры – это химичечски синтезированные олигонуклеотидной природы затравки для ПЦР, определяющие границы амплифицируемого участка ДНК матрицы и комплементарные противоположным ее цепям. Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующей последовательности нуклеотидов на противоположной цепи ДНК.

3-ий этап. Элонгация – достраивание цепей ДНК при температуре 70-72^оС в течение 20-40 сек. Комплементарное достраивание цепей ДНК идет в направлении от 5’ конца к 3’концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служит вносимый дНТФ. этот процесс катализируется ферментом Tag-полимеразой. Образовавшиеся в первом цикле синтеза новые ДНК служат исходным материалом для второго цикла, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (амплификона) и т.д. Таким образом, вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации – это и есть цепная реакция ПЦР.

Количество циклом может быть 25-40, в среднем 30 циклов. Следовательно, если в начальном растворе находилась одна ДНК, то после 30 циклов их будет 10⁸. Это является критическим порогом чувствительности, достаточным для достоверной идентификации. При содержании в ПЦР-пробирке около 10 молекул ДНК-матриц, как правило, достаточно 35 циклов.

Пятью основными компонентами ПЦР являются следующие:

1. фермент Tag-ДНК-полимераза;

2. пара олигонуклеотидных праймеров;

3. 4 типа дезоксинуклеозидтрифосфатоф (дНТФ);

4. копируемая ДНК;

5. ионы Mg+2.

Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минеральное масло.

Фермент Tag-ДНК-полимераза при оптимальных условиях ПЦР содержится в 50-100 мкл реакционной смеси в количестве 0,5-2 единицы. Фермент и синтезирует цепь ДНК до 1000 пар оснований в минуту.

Праймеры – это короткие, длиной 20-30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комплементарные 3'-концам цепей копируемой ДНК-матрицы. Праймеры ограничивают фрагмент ДНК, который будет миллионы раз скопирован ферментом Tag-ДНК-полимеразой, присоединяющейся к 3'-концам праймеров и достраивающей их до заданной длины в несколько сот или тысяч пар оснований.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ): дАТФ, дТТФ, дГТР и дЦТР в реакционной смеси содержатся в эквивалентных концентрациях от 200 до 500 мкм, т.к. избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание нуклеотидов в ПЦР.

Ионы Mg необходимы для функционирования фермента Tag-ДНК-полимеразы. Средние величины конценрации магния в ПЦР составляют около 2-3 мМ.

Буферный раствор должен обеспечивать оптимальные условия для работы фермента. Наиболее распространен Трис-HCl-буфер, который удерживает рН во время ПЦР между 6,8 и 7,8, содержит желатин или бычий сывороточный альбумин и детергенты для стабилизации фермента, 50 мМ KCl.

Минеральное масло наслаивается на поверхность реакционной смеси для предотвращения испарения в процессе ПЦР.

ПЦР-анализ состоит из трех стадий:

1. Подготовка пробы биологического материала.

2. Амплификация.

3. Детекция продуктов амплификации.

одготовка пробы биологического материала.

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР. Иногда бывает достаточно прокипятить образец в течение 5-10 минут; однако в большинстве случае требуются более сложные методы, а именно:

ü методика получения чистого препарата ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом;

ü метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента – гуанидина тиоционата, и последующей сорбцией ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное молоко и тд.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера.

ü метод пробоподготовки основанный на использовании ионообменников типа Chilex, которые в отличии от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике.

ü экспресс метод быстрой экстракции ДНК или РНК из различных материалов составляет термокоагуляционное концентрирование молекулы ДНК микроорганизма. Использование экспресс метода приводят к значительным потерям ДНК (от 12 до 22 %), в результате чего формируется определенный процент ложноотрицательных результатов.

Общее количество ДНК, вносимой в пробирку для ПЦР, не должно превышать 1 мкг, ибо большой избыток неспецифической ДНК снижает специфичность и чувствительность ПЦР-амплификации ДНК-матрицы.

мплификация.

Во время следущей процедуры – амплификации – в образец, содержащий ДНК возбудителя, вносится в небольшую пробирку с компонентами, обеспечивающими протекание ПЦР: два вида праймеров, два энзима (Tag-ДНК-полимераза и N-урацилгликолаза) и 4 вида нуклеотида А, Г, Ц, У.

Для проведения ПЦР используется специальное устройство (термоциклер или ДНК-амплификатор), позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси. В первом цикле осуществления ПЦР образец нагревается до температуры 94^оС для разделения двух комплементарных нитей ДНК. Затем температура снижается до 40-60^оС, при этом праймеры присоединяются к единичной цепи ДНК, после чего температура вновь поднимается до 72^оС (при которой наиболее выражена активность полимеразы). Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3-х минут.

Для контроля реакции амплификации используются контроли. В качестве «положительного контроля» используют препарат ДНК искомого микроорганизма. «Положительный контроль» позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции.

Для контроля хода амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль». Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма.

Существует 6 основных способов, при помощи которых можно повысить количество амплифицированной ДНК (усилить ПЦР-сигнал) при низкой концентрации ДНК-матрицы (вируса, бактерии, мутантных генов):

1. Усиление денатурации ДНК-матрицы: денатурировать ДНК при 94-99^оС до начала ПЦР или удлинить начальную денатурацию до 305 минут.

2. Увеличение специфичности праймеров.

3. Подбор оптимальных концентраций реагентов и температуры отжига.

4. Применение «горячего старта»: произойдет увеличение выхода специфического продукта ПЦР.

5. Увеличение продолжительности ПЦР до 40 циклов и использование ПЦР с «вложенными» праймерами.

6. Применение более чувствительной гибридизационно-ферментативной детекции амплифицированной ДНК.

Возможно осуществление одновременного определения нескольких инфекий в одной реакции амплификации, если для определяемых инфекций совпадают программы проведения реакций – метод мультиплексной (мультипраймерной) ПЦР. Для этого в амплификационную смесь добавляется равный объем растворов праймеров для различных инфекций, при этом объем добавляемой деионизированной воды уменьшается на объем дополнительно добавленных раствором праймеров. Следует, однако, отметить, что в этом случае чувствительность реакции уменьшается пропорционально разбавлению. Поэтому, рекомендуется одновременно определять не более 3-х инфекций за одну реакцию.

 

Задание 2.

Изучите принцип методов детекции фрагментов ДНК возбудителей.

Для визуализации результатов амплификации используют различные методы детекции продуктов амплификации. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Детекция продуктов амплификации может иметь место и по флюоресцентному сигналу, как в методе ПЦР в режиме реального времени (Реал-тайм ПЦР). Причем Реал-тайм ПЦР позволяет также проводить количественный анализ исследуемой нуклеиновой кислоты.