Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофоров

УФ-спектроскопия ДНК

Теория поглощения света

Световая волна состоит из взаимно перпендикулярных электрического и магнитного полей, амплитуды которых по мере распространения в пространстве изменяются по синусоиде. Энергия волны Е равна

где h - постоянная Планка,

с - скорость света,

l - длина волны,

n - частота.

Когда волна сталкивается с молекулой, она может либо рассеиваться (т.е. изменять направление распространения), либо поглощаться (т.е. её энергия передаётся молекуле). Относительная вероятность протекания того или иного процесса является свойством той молекулы, с которой произошло столкновение. Если произошло поглощение электромагнитной энергии света, о молекуле говорят, что она возбуждена или перешла в возбужденное состояние.

Молекула или часть молекулы, которая может быть возбуждена посредством поглощения света в видимой и ближней УФ-области, называется хромофором.

Ультрафиолетовая область является коротковолновой областью спектра, с одной стороны примыкающей к видимой её части, а с другой переходящей в рентгеновский спектр. Весь УФ-спектр делят на ближний с длиной волны 400-300 нм, примыкающий к видимой области (400-800 нм), дальний УФ (300-200 нм) и вакуумный (200-50 нм). 1 нанометр=10^-9м = 10Å).

Абсорбционная УФ-спектроскопия изучает спектры поглощения. Поглощение энергии происходит с наибольшей вероятностью только в том случае, если квант поглощенной энергии соответствует разности энергий квантованных состояний. Таким образом, свет с длиной волны l поглощается только тогда, когда

где Е₁ - энергетический уровень молекулы до поглощения,

а Е ₂- энергетический уровень, достигаемый в результате поглощения.

Изменение энергетического состояния при испускании или поглощении кванта называется переходом. Упрощенно переход между электронными энергетическими уровнями соответствует энергии, необходимой для перемещения электрона с одной орбитали на другую. Зависимость вероятности поглощения от длины волны называется спектром поглощения. Задача абсорбционной спектроскопии состоит в накоплении и анализе данных по поглощению.

Итак, поглощение световой энергии в видимой и УФ-области связано с различными типами электронных переходов. Оптические спектры атомов связаны с квантовыми переходами электронов внешней электронной оболочки. При объединении атомов в молекулу обобществленные (валентные) электроны образуют внешнюю оболочку и остаются ответственными за оптические спектры. Для биологических макромолекул типичны переходы в дальней УФ области спектра.

 

Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофоров

В некоторых случаях на интенсивность и положение полосы поглощения влияет природа растворителя или окружение хромофора, причем в результате полоса может сдвигаться как в длинноволновую, так и в коротковолновую область. Согласно старой номенклатуре:

а) батохромный сдвиг (или красный сдвиг) – в сторону длинных волн. Такой сдвиг могут вызывать, например, алкильные группы, расположенные по соседству с хромофором;

б) гипсохромный сдвиг (или синий) – в сторону коротких волн;

в) гиперхромный эффект – повышение интенсивности поглощения;

г) гипохромный эффект – понижение интенсивности поглощения (рис.11).

Рисунок 11 – Эффекты изменения интенсивности и смещения максимума поглощения.

 

Применение УФ-спектроскопии для идентификации и анализа полимеров ограничено соединениями, содержащими хромофорные группы. Метод УФ-спектроскопии используют также для определения содержания в полимерах различных примесей следов веществ, дающих характеристические линии поглощения в исследуемой области УФ-спектра.

Электронные переходы полипептидных и полинуклеотидных цепей и, тем самым, белков и нуклеиновых кислот расположены в УФ-области спектра. Полосы поглощения пептидной связи — СО — NН — лежат в области 185 - 240 нм. Азотистые основания в нуклеиновых кислотах поглощают свет в области 260 нм. Таким образом, белки и нуклеиновые кислоты бесцветны, они не поглощают видимый свет.

Спектр поглощения хромофора определяется в первую очередь химической структурой молекулы. Однако l_макс и e претерпевают заметные изменения и под влиянием окружения. Имеется в виду влияние рН, полярности растворителя или соседних молекул и относительная ориентация соседних хромофоров. Именно эти факторы лежат в основе использования абсорбционной спектроскопии для характеристики макромолекул. Рассмотрим в качестве примера эффект ориентации.

Величины l_макс и e существенно зависят от геометрических особенностей молекул. Наиболее известна гипохромия нуклеиновых кислот, т. е. понижение коэффициента погашения нуклеотида, при условии, что нуклеотид входит в состав одноцепочечного полинуклеотида, в котором нуклеиновые основания сближены и расположены друг над другом. Дальнейшее понижение e наблюдается для двухспиральных полинуклеотидов, т.к. основания в этом случае ещё более упорядочены (рис.12).

1 – двуцепочечная ДНК; 2 – одноцепочечная ДНК; 3 – после гидролиза до свободных нуклеотидов

Рисунок 11 - Спектры поглощения ДНК фага Т7.

Гипохромный эффект ДНК

В подавляющем большинстве случаев изменение конформации белков, нуклеиновых кислот и других биополимеров вызывает значительные изменения в ультрафиолетовых спектрах поглощения. На рис. 12. приведены спектры поглощения ДНК фага Т7 в двухцепочечной и одноцепочечной формах, а также после гидролиза до свободных нуклеотидов. Из рисунка видно, что в данном случае происходит значительное изменение интенсивности поглощения, но сама форма спектра меняются незначительно. Этот результат характерен для всех биополимеров. Приведенный пример иллюстрирует общее правило, согласно которому интенсивность поглощения чрезвычайно сильно меняется, если она связана с квантовыми переходами электронов, сопровождающими изменение конформации молекулы. Если в результате конформационного изменения интенсивность поглощения уменьшается, то это явление называется гипохромным эффектом (гипохромизмом), а если, напротив, интенсивность поглощения увеличивается, то это называется гиперхромным эффектом (гиперхромизмом). Эти эффекты отражают изменения в конформации биополимеров и чрезвычайно широко используются для изучения механизмов биологических процессов. Гипохромный эффект, сопровождающий изменение структуры биополимера, проявляется в спектрах поглощения в широкой области длин волн. Изменение интенсивности поглощения весьма значительно, и экспериментальное определение гипохромного сдвига не требует какой-либо специальной аппаратуры.