Количественное определение хлорофиллов, каротинов и ксантофиллов в зеленых растений можно проводить с использованием двух принципиально различных подходов: с предварительным разделением и без него. При этом расчеты проводят как с использованием калибровочных графиков, так и готовых формул с применением известных значений молярных коэффициентов светопоглощения. Стоит учитывать, что результаты анализа без разделения пигментов очень сильно зависят от условий проведения, а также соотношения определяемых веществ и характеризуются более высоким уровнем погрешности.
4.1 Количественное определение пигментов без их предварительного разделения
Количественный анализ без разделения и без использования стандартов заключается в приготовлении вытяжки пигментов, определении оптической плотности полученного раствора на спектрофотометре при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения определяемых компонентов, и последующем математическом расчете.
Оптическую плотность вытяжки пигментов, полученной в опыте 1, определяют при длинах волн 662, 644 и 440 нм (в случае 100%-ного ацетона), 663, 644, 452,5 нм (в случае 85%-ного ацетона) или 665, 649 и 440 нм (для этилового спирта), используя кюветы с толщиной поглощающего слоя 10 мм.
Концентрацию хлорофиллов a и b, а также каротиноидов рассчитывают по различным формулам в зависимости от вида и концентрации используемого растворителя:
- для 100%-ного ацетона (по Хольму-Веттштейну)
(1.1)
(1.2)
(1.3)
- для 85%-ного ацетона (по Реббелену)
(1.4)
(1.5)
(1.6)
- для 96%-ного этанола
(1.7)
(1.8)
где 
- концентрации хлорофиллов a, b и каротиноидов соответственно, мг/ дм3;
- суммарная концентрация хлорофиллов a и b в вытяжке, мг/дм3;
- оптическая плотность вытяжки при длине волн i нм соответственно (толщина поглощающего слоя – 10 мм).
Содержание пигментов в сырой массе исследуемого объекта А, в %, вычисляют по формуле (1.9):
(1.9)
где 
- концентрация соответствующего пигмента в вытяжке, мг/дм3;
- объем вытяжки, дм3;
- масса навески исследуемого объекта, г.
Содержание пигментов в пересчете на абсолютно сухой исследуемый объект B, в %, определяют по формуле (1.10):
(1.10)
где 
- массовая доля влаги в исследуемом образце, %.
Для определения влаги в свежей зеленой листостебельной массе исследуемый объект измельчают, хорошо перемешивают и из общей массы берут две параллельные навески по 25-50 г, взвешенных на весах с точностью до 0,001 г. Навески помещают в предварительно высушенные до постоянной массы бюксы. Бюксы с навесками помещают на 20-30 минут в сушильный шкаф, прогретый до 120-130оС для инактивации ферментов, а затем высушивают при 105оС до постоянной массы.
Массовую долю в исследуемых объектах , в %, вычисляют по формуле (1.11):
(1.11)
где 
- масса бюкса с навеской до высушивания, г;
- масса бюкса с навеской после высушивания, г;
- масса пустого бюкса, г.
Результаты опыта приводят в таблице 1.4.
Таблица 1.4
| Исследуемый объект | Используемый растворитель | 
| 
| 
|  , мг/дм3;  , %;  , %
|  , мг/дм3;  , %;  , %
|  , мг/дм3;  , %;  , %
|  , %
|
4.2 Количественное определение пигментов после их предварительного разделения
В качестве стандартов при построении калибровочных зависимостей при определении содержания пигментов в зеленых листьях наиболее часто используют раствор Русселя (раствор K2Cr2O7) при анализе каротиноидов и раствор Гетри при анализе хлорофиллов.
Приготовление стандартного раствора Русселя. Химически чистый трижды перекристаллизованный K2Cr2O7 высушивают до постоянной массы. Навеску соли массой 0,36 г, взвешенную с точностью до четвертого десятичного знака, растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 дм3. Стандартный раствор Русселя по оптической плотности соответствует раствору каротина с концентрацией 2,08 мг/дм3.
Приготовление стандартного раствора Гетри. В стаканчик вместимостью 50 см3 помещают взвешенные с точностью до четвертого десятичного знака навески 
(2,85 г) и K2Cr2O7 (10 г). В мерной колбе объемом 1 дм3, в которую предварительно вносят 100 мл водного раствора аммиака с массовой долей 7%, растворяют навески солей. Уровень раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой. Стандартный раствор Гетри по оптической плотности соответствует раствору водорастворимых производных хлорофилла с концентрацией 85 мг/дм3.
Серию калибровочных растворов готовят путем разбавления стандартных растворов в колбах объемом по 100 см3. Данные для построения калибровочных графиков приводят в таблицах 1.5 и 1.6.
Таблица 1.5
| Объем раствора Русселя, см3 | |||||||
| Масса каротина, мг/дм3 | |||||||
| Оптическая плотность |
Таблица 1.6
| Объем раствора Гетри, см3 | |||||||
| Концентрация производных хлорофилла, мг/дм3 | |||||||
| Оптическая плотность |
В тетради приводят полученные калибровочные графики.
Оптическую плотность растворов пигментов определяют при длинах волн 650 нм (для определения хлорофиллов) и 440 нм (для определения каротина и ксантофиллов), используя кюветы с толщиной поглощающего слоя 10 мм, а в качестве раствора сравнения – ацетон при определении хлорофиллов и петролейный эфир при определении каротиноидов. При необходимости проводят разбавления исследуемых растворов.
Расчеты содержания пигментов в сырой массе исследуемого объекта А, в %, рассчитывают по формуле (1.12):
, (1.12)
где - концентрация пигмента (или группы пигментов), определенная по калибровочному графику, мг/дм3;
- степень разбавления;
- объем раствора пигмента, полученный после хроматографического разделения, см3;
- объем раствора пигментов в петролейном эфире, нанесенный на лист хроматографической бумаги, см3;
- общий объем раствора пигментов в петролейном эфире, см3;
- объем спиртовой или ацетоновой вытяжки пигментов, взятый для их перевода в петролейный эфир, см3;
- спиртовой или ацетоновой объем вытяжки пигментов, дм3.
Расчет содержания пигментов в абсолютно сухом исследуемом объекте, 
, проводят по формуле (1.10).
Результаты опыта заносят в таблицу 1.7.
Таблица 1.7
| Пигмент или группа пигментов | Объект | Длина волны, нм | Оптическая плотность | , мг/дм3
|
| , см3
| , см3
| , см3
| , см3
| , дм3
|  , %
| , %
| , %
|
| Хлорофиллы | |||||||||||||
| Каротиноиды |
