ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ФОРМ БАКТЕРИЙ. ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА.
Цель занятия. Овладеть методиками приготовления основных микробиологических препаратов. Изучить морфологические формы бактерий на примере чистых культур микроорганизмов и микрофлоры полости рта.
Материалы и оборудование: посевы микроорганизмов на чашках Петри; спички, карандаш по стеклу; вазелин; иммерсионное масло; микроскоп; микробиологическая петля с петледержателем; спиртовка; предметные стекла; покровные стекла; шпатель Дригальского; пипетка Пастера; прибор для окрашивания и промывания мазков; полоски фильтровальной бумаги.
Задачи:
1. Овладеть методами приготовления микробиологических препаратов.
2. Изучить морфологические формы бактерий на примере чистых культур микроорганизмов.
3. Исследовать микрофлору полости рта.
Задание 1. Изучить морфологические формы бактерий.
Препараты (мазки) готовят из бактериальных культур. Чистая бактериальная культура - это культура, состоящая из микробных клеток одного вида. По способу получения она представляет собой потомство (клон) одной клетки.
В лаборатории микроорганизмы выращивают в питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы и чашки Петри. Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется инокуляцией (посевом). Перед посевом следует надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название микроорганизма и дату посева. Надпись делают маркером на стекле или на наклеенной этикетке. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей, если микроорганизмы выращены на плотной среде. В том случае, когда пересевают культуры микроорганизмов, выросшие в жидкой питательной среде, пользуются стерильной пипеткой. Использованную пипетку следует немедленно перенести в дезинфицирующий раствор, не касаясь ею окружающих предметов.
При приготовлении препаратов из культуры бактерий, выросших на питательных средах, необходимо соблюдать правила асептики.
К морфологическим свойствам бактерий относятся не только форма, но и размер клеток, расположение клеток в пространстве, наличие спор и капсул, подвижность и характер окраски бактерий по Граму. Наиболее типична морфология бактерий в молодых культурах.
Среди основных морфологических форм бактерий различают:
1. шаровидные (кокковые), которые по характеру взаиморасположения делятся на:
- микрококки (лат. micro - маленький). В природе встречаются в виде одиночных шаровидных клеток.
Micrococcus luteus
- диплококки (лат. diploos - двойной) – бактерии, соединенные по две клетки;
Neisseria meningitidis
- тетракокки (лат. tetra — четыре) – группируются по четыре клетки;
Тетракокки
- стрептококки (лат. streptos - цепь) – бактерии, образующие в результате деления клеток в одной плоскости разнообразной длины цепочки.
Streptococcus mutans
- сарцины (лат. sarceo - соединяю) – шаровидные бактерии, группирующиеся по 8 клеток. Располагаются они в виде куба, с каждой стороны которого по 4 клетки. Такая форма возникает в результате деления клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях.
Sarcina lutea
- стафилококки (лат. staphylo - гроздь) – клетки вследствие беспорядочного деления образуют скопления, напоминающие по внешнему виду гроздья винограда.
Staphylococcus aureus
2. палочковидные, которыеразличаются по форме:
E.coli
- правильная (энтеробактерии (представители семейства Enterobacteriaceae), псевдомонады (род Pseudomonas));
Pseudomonas aeruginosa
- неправильная (коринебактерии (Corynebacterium));
Коринебактерии
по размеру:
мелкие (бруцеллы (Brucella), бордетеллы (Bordetella));
средние (бактероиды (Bacteroides), кишечная палочка (E.coli);
крупные (бациллы (Bacillus), клостридии (Clostridium));
По форме концов
обрубленные (бациллы);
закругленные (сальмонеллы, псевдомонады);
заостренные (фузобактерии);
утолщенные (коринебактерии);
по характеру взаиморасположения все палочки делятся на:
расположенные одиночно;
диплобактерии и диплобациллы (сцепленные попарно);
стрептобактерии и стрептобациллы (сцепленные в цепочку);
3. извитые формы - по характеру и количеству завитков они делятся на:
вибрионы (слегка изогнутые палочки или неполные завитки);
спириллы (один или несколько завитков);
спирохеты, которые в свою очередь, делятся на:
лептоспиры (завитки с загнутыми крючкообразными концами - S-образная форма);
боррелии (4 -12 неправильных завитков);
трепонемы (14 -17 равномерных мелких завитков).
Actinomyces israeli
4. нитчатые формы, к которым относят актиномицеты (Actinomycetales). Клетки актиномицетов обычно имеют вид длинных и ветвящихся нитей, напоминающих в ряде случаев мицелий одноклеточных грибов (т.н. «тонкий мицелий»). Нити мицелия имеют длину 100–600 мкм и толщину 0,2–1,2 мкм.
Размеры бактерий в среднем составляют 0,5—5 мкм. Escherichia coli, например, имеет размеры 0,3—1 на 1—6 мкм, Staphylococcus aureus — диаметр 0,5—1 мкм, Bacillus subtilis — 0,75 на 2—3 мкм. Крупнейшей из известных бактерий является Thiomargarita namibiensis, достигающая размера в 750 мкм (0,75 мм). Спирохеты могут вырастать в длину до 250 мкм при толщине 0,7 мкм. В то же время к бактериям относятся самые мелкие из имеющих клеточное строение организмов. Mycoplasma mycoides имеет размеры 0,1—0,25 мкм.
Задание 2. Исследовать микрофлору ротовой полости.
Вся нормальная микрофлора человека подразделяется на резидентную (постоянную – автохтонную (облигатную), составляющую до 90% присутствующих в организме микробоорганизмов, факультативную (аллохтонную) — менее 9,5%) и транзиторную (случайную) — до 0,5 %. Около 20 % микроорганизмов от общего числа обитает в полости рта (более 200 видов), 18-20% приходится на кожные покровы, 15-16% — на глотку, а больше всего микроорганизмов (до 40%) — в желудочно-кишечном тракте.
Нормальная микрофлора организма начинает формироваться при рождении ребенка. В полости рта новорожденного она представлена лактобациллами, негемолитическими стрептококками и непатогенными стафилококками. Главными обитателями полости рта у взрослого человека являются бактерии преимущественно анаэробного типа дыхания (3/4 всех микробных видов), остальные виды представлены факультативными анаэробами. В ротовой полости самую большую группу бактерий составляют кокки.
Род Staphylococcus. Стафилококки в полости рта здорового человека встречаются в среднем в 30% случаев. В зубном налете и на деснах здоровых людей присутствуют в основном Staphylococcus epidermidis. У некоторых людей в полости рта могут обнаруживаться и Staphylococcus aureus. Обладая значительной ферментативной активностью, стафилококки принимают участие в расщеплении остатков пищи в полости рта.
Патогенные стафилококки, встречающиеся на слизистой носоглотки и в полости рта, являются частой причиной эндогенных инфекций, вызывая различные гнойно-воспалительные процессы полости рта.
Staphylococcus aureus
Род Streptococcus. Стрептококки являются основными обитателями полости рта (в 1 мл слюны — до 
стрептококков). В окрашенных мазках стрептококки располагаются в виде цепочек, грамположительны. Большинство из них являются факультативными анаэробами или микроаэрофилами, но встречаются и строгие анаэробы (например, пептострептококки). Стрептококки сбраживают углеводы с образованием молочной кислоты, вызывая молочнокислое брожение. Кислоты, появляющиеся в результате брожения, подавляют рост ряда гнилостных микробов, встречающихся в полости рта. Колонизация оральными стрептококками различных участков ротовой полости имеет качественные и количественные вариации в зависимости от условий жизни. S.salivarius и S.mitis в 100% случаев присутствуют в полости рта. S.mutans и S.sanguis обнаруживаются в большом количестве на зубах, a S.salivarius — главным образом на поверхности языка.
Streptococcus mutans
Род Veillonella. Вейллонеллы — это мелкие грамотрицательные кокки, располагаются кучками, парами или короткими цепочками. Строгие анаэробы.
Veillonella parvula
Род Neisseria. Нейссерии — грамотрицательные диплококки. Строгие аэробы. Нейссерии всегда в большом количестве встречаются в полости рта здоровых людей (до 1—3 млн. в 1 мл слюны).
В полости рта помимо кокков обитают разнообразные палочковидные формы бактерий. Род Fusobacterium включает более 10 видов, изолированных из ротовой полости человека и животных. Фузобактерии — грамотрицательные анаэробные палочки, в культуре выглядят как прямые или искривленные палочки, короткие нити с заостренными концами, напоминающие веретено.
Лептотрихии (род Leptotrichia содержит один вид - Leptotrichia buccalis) имеют вид длинных нитей разной толщины с заостренными или вздутыми концами, дают густые сплетения, могут располагаться попарно в виде зернистых палочек.
Leptotrichia buccalis
Лептотрихии присутствуют в полости рта постоянно (чаще у шейки зубов) в большом количестве (в 1 мл слюны 
- 
Чтобы поселиться в полости рта, бактерии должны прикрепиться к зубам или к слизистой оболочке и за счет этого обеспечить себе устойчивость к току слюны. Адгезия опосредована адгезинами поверхности бактерий и рецепторами эпителиоцитов ротовой полости, структурами зубной эмали. Микробные адгезины состоят из полисахаридов, липотейхоевых кислот, а также могут быть представлены гликозилтрансферазами и белками, связанными с углеводами (лектины). Эти адгезины являются компонентами клеточной стенки или ассоциированы с такими структурами бактериальной клетки, как пили, фимбрии, фибриллы или капсулы. Рецепторами могут быть компоненты слюны (муцины, гликопротеины, амилаза, лизоцим, богатые пролином белки) или бактериальные компоненты (гликозилтрансферазы или глюканы), которые связаны с ротовыми поверхностями. В процессе адгезии происходят неспецифические физико-химические взаимодействия между бактериями и эпителиоцитами (например, липотейхоевые кислоты клеточной стенки бактерий связываются с отрицательно заряженными компонентами клеток хозяина через ионы кальция, водородные или гидрофобные связи). Некоторые бактерии могут колонизировать поверхность слизистых или зубов, закрепляясь на поверхностных структуpax других бактерий, т.е. осуществляя коагрегацию. Стрептококки разных видов коагрегируются с актиномицетами, F. nucleatum, Veillonella, Haemophilus parainfluenzae. F.nucleatum связывается с Porphyromonas gingivalis, Haemophilus parainfluenzae и Treponema spp. Коагрегация — пример комменсализма и синергизма, которые возникают между микробными видами.
Учебная карта к лабораторной работе № 2.
Задание 1. Освоить приготовление препаратов «висячая» и «раздавленная» капля из чистых культур микроорганизмов. Законспектировать (кратко) методику получения препаратов «висячая» и «раздавленная» капля. Получить препараты «висячая» и «раздавленная» капля для различных морфологических форм из чистых культур микроорганизмов.
В приготовленных препаратах «висячая» и «раздавленная» капля изучить морфологию клеток и зарисовать форму и расположение клеток в пространстве в таблице 1.
Таблица 1
| Культура | Препарат | Морфологическое описание | Схематическое изображение |
Задание 2. Сделать выводы о морфологических формах изученных микроорганизмов.
Приготовить препараты «раздавленная капля», взяв мазки из зубодесневого кармана и с языка. Изучить морфологию клеток и заполнить таблицу 2.
Таблица 2. Морфология микроорганизмов ротовой полости.
| Мазок | Морфологическое описание наблюдаемых микроорганизмов | Схематическое изображение (рисунок) | Вывод о возможной таксономической принадлежности наблюдаемых микроорганизмов |
| Из зубодесневого кармана | |||
| С языка |
Сделать вывод о качественном составе микрофлоры рта.
Контрольные вопросы:
1. Методики приготовления препаратов «висячая» и «раздавленная» капля.
2. Основные морфологические типы бактерий. Использование морфологической характеристики в идентификации микроорганизмов.
3. Микрофлора человека и ее значение для организма.
4. Понятие об автохтонных, аллохтонных микроорганизмах.
