Определение числа микробных клеток в суспензии - один из наиболее важных параметров при характеристике, образованной в результате культивирования биомассы. Существует несколько методов определения концентрации биомассы.
Число одноклеточных организмов можно определить микроскопическим методом, подсчитав отдельные клетки в точно измеренном малом объеме. Такой подсчет обычно делается на специальных предметных стеклах - счетных камерах. На них начерчены квадраты известной площади, и их конструкция позволяет внести между предметным и покровным стеклами слой жидкости известной толщины. Следовательно, можно точно вычислять объем жидкости, покрывающей каждый квадрат. Такой прямой подсчет называют определением общего числа клеток. Он учитывает как живые, так и мертвые клетки, поскольку их нельзя различить в случае бактерий. Визуальные подсчеты имеют то преимущество, что наблюдатель может различить вида микроорганизмов,
которые необходимо подсчитать, а другие типы частиц или организмов в среде. Основное ограничение прямого микроскопического подсчета численности микробной популяции - необходимость, иметь относительно высокие концентрации в суспензии. Большое увеличение, позволяющее регистрировать бактерии, в то же время ограничивает объем жидкости, который можно подвергнуть тщательному исследованию под микроскопом. Тем не менее в известном объеме должно содержаться достаточное число клеток, чтобы сделать подсчет статически значимым. В результате данным методом можно анализировать с любой степенью точностью только те суспензии, которые содержат не менее 10 млн клеток в 1 мл.
Для прямого подсчета клеток в суспензии используют также электронный прибор, названный по имени его изобретателя счетчиком Коултера. Порцию суспензии пропускают через очень тонкое отверстие в небольшой стеклянной трубке. Это отверстие служит, кроме того, и для замыкания электрического тока, проходящего через среду между электродами, расположенными внутри трубки и на ее внешней поверхности. Определение основано на различии в проводимости между бактерией и окружающей средой. Каждый раз, когда бактериальная клетка проходит через отверстие, проводимость падает, что обнаруживается и регистрируется электронным счетчиком. Прибор может различать величину и длительность изменений проводимости и таким образом регистрировать и записывать не только число клеток в популяции, но и распределение по размеру. Отверстие, обычно используемое для подсчета бактерий, имеет диаметр 30 мкм, поэтому среда, в которой находятся клетки, должна быть тщательно освобождена от посторонних частиц (например, пыли), так как мельчайшие их них будут подсчитаны как бактерии, а более крупные закупорят отверстие. Электронные приборы для счета удобны при большом числе измерений и уменьшают ошибку выборки, так как дают возможность подсчитать большое число проб.
Для ориентировочного подсчета общего количества клеток в суспензии часто пользуются бактериальным стандартом мутности, который содержит в единице объема (I мл) заданное количество микробных клеток (м.к.). Стандарт мутности для определения концентрации микробной взвеси, выпускаемым Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля биологических препаратов имени П.А. Тарасевича, представляет взвешенные в дистиллированной воде частицы стекла «Пирекс» диаметром от 0.5 до 3.5 мкм. Взвесь этого стекла химически устойчива, не коагулирует при седиментации частиц, при взбалтывании осадка образует взвесь исходной концентрации и мутности.
Стандарт состоит из двух запаянных пробирок - эталонов, эквивалентных по степени мутности 5 и 10 международным единицам мутности. К комплекту бактериальных эталонов прилагается шрифтовая таблица, содержащая набор различных шрифтов, две пустые пробирки, диаметр, толщина стенок и цвет стекла которых точно соответствует пробиркам - эталонам, так как при сравнении микробной взвеси одной концентрации, содержащейся в пробирках разных диаметров, мутность жидкости будет неодинаковой. Определение концентрации микробной взвеси с помомощью стандарта мутности проводят следущим образом:
Небольшое количество микробной взвеси, в которой необходимо определить концентрацию биомассы(0.1-0.2 мл), переносят в стандартную пробирку или близкую к ней по диаметру и толщине стенок. Далее к содержимому этой пробирки небольшими, но точно учитываемыми порциями приливают изотонический раствор хлорида натрия, сравнивая при этом мутность опытной побирки с эталоном 10 единиц. Сравнение степени мутности в опытной и эталонной пробирках производят невооруженным глазом при хорошем дневном освещении в лучах падающего света, подложив под обе пробирки шрифтовую таблицу.
Зная количество физиологического раствора, прибавленное к определенному объему микробной взвеси, можно определить число микробных клеток, содержащихся в 1 мл. исходной бактериальной суспензии.
Например, при приготовлении микробной взвеси бацилл, по мутности соответствующей 10 единицам эталона (концентрации 1 млрд. м.к./мл), было взято 0.1 мл исследуемой суспензии и 1.5 мл физиологического раствора. Полученная взвесь в объеме 1.6 мл имеет концентрацию эталона, то есть 1 млрд. М.к. в 1 мл. Таким образом, в 1 мл исходной взвеси содержится 1.6 млрд. клеток, а концентрация суспензии – 16 млрд. м.к./мл.
Число одноклеточных микроорганизмов можно подсчитать также после высева на плотную питательную среду в чашки Петри (макрокультуральный метод), поскольку жизнеспособные клетки, пространственно отдаленные друг от друга во всем объеме агаризованной среды или на ее поверхности, в процессе роста образуют отдельные макроскопические колонии. Следовательно, приготовив соответствующие разведения бактериальной популяции и использовав их для засева подходящей среды, можно определить число жизнеспособных клеток в исходной суспензии путем подсчета числа вырастающих после инкубации колоний и умножения этой цифры на коэффициент разведения. В отличие от прямого микроскопического или электронного подсчета, такой метод обычно называют определением концентрации жизнеспособных клеток, поскольку он позволяет учесть только те микроорганизмы, которые могут расти на использованной для посева среде.
Методика определения концентрации живых клеток заключается в следующем:
Исследуемую микробную взвесь последовательно разводят в пробирках с 10-ти кратным объемом физиологического раствора. Для этого в стерильные пробирки наливают по 0.9 мл. стерильного физиологического раствора. Количество пробирок зависит от общей концентрации микробной взвеси, так как ее разводят так, чтобы в последней пробирке содержалось примерно тысяча микробных клеток в 1 мл разводящей жидкости. В первую пробирку ряда вносят 0.1 мл. исследуемой взвеси, закрывают ватно-марлевой пробкой и тщательно, но осторожно перемешивают, вращая несколько раз между ладонями. Затем из этой пробирки стерильной градуированной пипеткой берут 0.1 мл взвеси и переносят во 2-ю пробирку ряда. Далее, после перемешивания 0.1 мл содержимого 2-й пробирки переносят стерильной градуированной пипеткой в 3-ю, из 3-й пробирки такое же количество – в 4-ю из 4-й – в 5-ю и так далее. Из последней пробирки ряда по 0.1 мл суспензии высевают на пластинки питательного агара в 3 чашки Петри и тщательно раскатывают посевную дозу до поверхности среды осторожным покачиванием чашки. После впитывания микробной взвеси в агар чашки с посевами помещают в термостат. Через 24 часа производят подсчет количества колоний в чашках с питательной средой. Из 3-х значений высчитывают среднее количество выросших колоний и определяют концентрацию живых клеток исследуемой суспензии (Сж):
п - среднее количество выросших колоний
а - количество пробирок, взятых для разведения культуры.
Определение концентрации жизнеспособных клеток является наиболее чувствительным методом количественного учета микроорганизмов, так как дает возможность зарегистрировать даже единичную живую клетку в суспензии.
Для установления процента жизнеспособности клеток в микробной популяции необходимо использовать метода отдельного определения общего числа клеток и числа жизнеспособных клеток в единице объема.
Процент жизнеспособности (К) вычисляется по следующей формуле:
, где
С ж - концентрация живых клеток, м.к./мл,
С общ - общая концентрация микроорганизмов в суспензии, м.к./мл.
ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ
1) Произвести посев бактериологической петлей микробной культуры, выданной преподавателем, в одну пробирку с жидкой питательной средой, в одну пробирку со скошенным агаром ("косяк") и на пластинку плотной питательной среды в чашке Петри.
2) Определить общую концентрацию живых и мертвых клеток во взвеси, полученной у преподавателя, с помощью бактериологического стандарта мутности. Результаты определения занести в табл. 1.
3) Определить концентрацию жизнеспособных клеток в той же микробной суспензии макрокультуральным методом. Результаты опыта занести в табл. 2.
4) Вычислить процент жизнеспособности микробной популяции по результатам определения общей и жизнеспособной концентрации клеток в суспензии.
Таблица 1. Результаты измерений общей концентрации биомассы
| Вид микроба | Объем взятой взвеси, мл | Объем добавленного физ. раствора, мл | Концентрация полученной взвеси, м.к./мл | Концентрация исходной взвеси, м.к./мл |
Таблица 2.Результаты определения концентрации живых клеток в биомассе.
| Кол-во пробирок | Объем физ. р-ра в пробирке, мл | Объем титруемой взвеси, мл | Объем посевной дозы, мл | Количество колоний | Концентрация живых клеток, | |||
| среднее | ||||||||
Отчет студента по выполненной работе должен содержать:
1) Цель работы.
2) Этапы выполнения работы.
3) Таблицы с результатами определения общей и жизнеспособной концентрации биомассы.
4) Расчет процента жизнеспособности микробной популяции.
5) Выводы по проделанной работе.
