Раздел 1. Значение биохимических анализов в практической медицине

Выбранная для исследования методика должна отличаться точностью, специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Удобнее применять методики, использующие готовые наборы реак­тивов заводского изготовления. Если это невозможно, следует обращать вни­мание на чистоту используемых реактивов, ибо использование реактивов неизвестной степени очистки может внести ошибку в проводимые исследо­вания.

Воспроизводимость метода зависит от случайных погрешностей при проведении осаждения, центрифугирования, пипетирования, а также от ста­бильности полученного продукта.

Для поддержания на высоком уровне воспроизводимости исследо­ваний удобно использовать контрольные сыворотки промышленного произ­водства.

В биохимии и клинической химии используются основные и про­изводные единицы СИ. Концентрацию веществ, молекулярная масса которых известна (например, концентрацию глюкозы, мочевины, мочевой кислоты в биологических жидкостях), выражают в единицах молярной концентрации моль/литр или в дольных единицах - миллимоль/литр, микромоль/литр.

Концентрацию веществ, у которых не установлена или точно не известна молекулярная масса, выражают в единицах массовой концентрации (или в массовых долях) - кг/л, г/л, мг/л, мкг/л и т.д. В этих же единицах вы­ражаются результаты определения содержания белков (альбумин, фибрино­ген, общий белок, гаптоглобин, общих липидов.).

Физико-химические методы в биохимии

Центрифугирование

Центрифугирование - метод разделения неоднородных систем, в том числе суспензий, в поле центробежных сил. В основе метода лежит следующий принцип: более крупные и более плотные частицы осаж­даются быстрее и собираются на дне пробирки. Рабочая часть центрифуги – ротор, в который помещают пробирки с исследуемой жидкостью. Центрифужные пробирки перед центрифугированием уравновешивают и в роторе ставят друг против друга.

В лабораторной практике центрифугирование чаще всего применяют для:

1) отделения форменных элементов от плазмы крови;

2) разделения субклеточных частиц;

3) осаждения денатурированных белков.

В клинической биохимии наиболее часто используют центрифуги общего назначения, которые способны давать максимальную скорость до 6000 об/мин. Для получения субклеточных частиц используют скоростные и ультрацен-трифуги. Ультрацентрифуги дают предельную скорость до 80 000 об/мин и центробежное ускорение до 500 000 g. Они снабжены холодильни­ком и ваку-умной установкой.

Фотометрия

Ф о т о м е т р и я - метод количественного анализа, основанный на измерении интенсивности поглощения или рассеяния веще­ством светового потока.

Светопоглощение или э к с т и н к ц и я прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и коэффици-енту молярной экстинкции. Коэффициент молярной экстинкции – величина поглощения, которую дает 1 моль вещества в 1 мл раствора при толщине слоя измеряемого раствора равной 1 см.

Экстинкция прямо пропорциональна интенсивности окраски раствора, которая может быть изначаль­ной (то есть определяемое вещество обуслов-ливает цвет раствора), либо приобретенной в процессе химической реакции.

Концентрацию определяемого вещества можно рассчитать двумя способами:

1) используя экстинкцию стандартного раствора с известной концентрацией опре­деляемого вещества. Для этого составляют пропорцию:

Е _ст. соответствует С _ст.

Е _оп. -"- С _оп.

С _ст. х Е _оп.

откуда С _оп.=;

Е _ст.

где Е _ст. - экстинкция стандартного раствора;

Е _оп. - экстинкция исследуемого раствора;

С _ст. - концентрация стандартного раствора;

С _ОП. - концентрация определяемого вещества.

2) Концентрация исследуемого вещества определяется с помощью калибровочного графика. Для построения калибровочного графика изме­ряют экстинкции нескольких растворов с известной концентрацией опреде­ляемого вещества.

Фотометрические приборы делятся на две большие группы: фото­электроколориметры и спектрофотометры.

В фотоэлектроколориметрах нужные спектральные диапазоны вы­деляют при помощи светофильтров (красного, зеленого, синего, фиолето­вого и т.д.). В спектрофотометрах участки спектра выделяют при помощи призм или дифракционных решеток, поэтому можно установить любую длину волны в заданном диапазоне. Обычно спектрофотометры - это при­боры более высокого класса, чем фотометры - в них можно выделить более узкий участок (более монохроматический) спектра, следовательно, точность измерения будет выше. Однако, все зависит от конкретной конструкции прибора.

Чаще всего в клинической биохимии фотометрия проводится в области 400-700 нм – это, так называемая, видимая область спектра. Свет с большей длиной волны относится к ближней инфракрасной области, измере­ния в которой приходится делать чрезвычайно редко. Свет с длиной волны короче 400 нм относится к ультрафиолетовому диапазону, причем, разли­чают ближнюю область с длиной волны 300-400 нм и коротковолновый диапазон 220-300 нм.

Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрас­ной областях применяются кюветы из обычного стекла. Для ближней ульт­рафиолетовой области нужны кюветы из специальных сортов стекла - увио­левые; в коротковолновой ультрафиолетовой области пригодны только кюветы из кварца или сапфира (высокой стоимости).

Последовательность операций при работе на спектрофотометрах или фотометрах различных конструкций несколько различаются, но имеется общий принцип. Сначала устанавливают нужную длину волны, выбирая светофильтр на фотометре или вращая соответствующую рукоятку на спектрофотометре. Следующий этап - выведение нуля. Для этого в кюветодержатель устанавли­вают кювету с контрольным раствором (растворитель или раствор, получен­ный в результате холостого опыта, то есть без проведения химической реак­ции). Изменяя интенсивность светового потока, выводят показания при­бора на величину шкалы, предусмотренную инструкцией (чаще всего - нуль). После этого устанавливают опытную или стандартную пробу и по шкале прибора проводят отсчет оптической плотности.

В биохимических лабораториях наиболее широко применяются фотоэлектроколориметры КФК-2, КМФЦ-2, БИАН-120 и др.; спектрофотометры СФ-16, СФ-26 и их современные модифика­ции.

Флюорометрия

Эффект флюоресценции проявляется в свечении исследуемого объекта под влиянием облучения светом с более короткой длиной волны.

Физический эффект флюоресценции заключается в том, что моле­кула исследуемого вещества поглощает квант света возбуждения (тот свет, которым облучается объект) и при этом переходит в новое, с большей энергией состояние. Через некоторый микропромежуток времени (он настолько мал, что им можно пренебречь) молекула исследуемого вещества излучает избыточную энергию в виде кванта света флюоресценции, что улавливается соответствующим прибором флюориметром.

. Аналитические методы, использующие флюоресценцию, осно­ваны на предположении, что при освещении светом одинаковой интенсивно­сти сила света флюоресценции пропорциональна содержанию исследуемого вещества. Однако такая пропорциональность соблюдается только в относи­тельно узком диапазоне концентраций, поэтому при исследовании нужно всегда с особой тщательностью прове­рять линейность калибровочного графика.

В биохимических лабораториях часто используются флюориметры типа ЭФ-3М, БИАР-130 и др.

Пламенная фотометрия

Соли металлов, попадая в пламя, способны окрашивать его. Это происходит потому, что при высокой температуре пламени молекулы рас­падаются на отдельные ионы, электроны которых непрерывно переходят из одного квантового состояния в другое, что сопряжено с испусканием или поглощением кванта света.

Метод, в котором измеряется окраска пламени, т.е. излучение, возни­кающее в результате перехода атомов из энергетически более высокого со­стояние в более низкое, называется пламенной фотометрией. Между интенсивностью окраски пламени и концентрацией измеряемого вещества имеется прямая зависимость.

В биохимическом практикуме этим методом определяются вещества (например, К и Na), способные интенсивно излучать свет, попадая в сравни­тельно низкотемпературное пламя (например, в пламя бытового газа).