А сыворотка крови

Практическая работа № 6

Тема: «Количественное определение пировиноградной кислоты колориметрическим методом (по Умбрайту)»

Пировиноградная кислота- один из главных метоболитов промежуточного обмена веществ. Содержание пирувата в крови здорового человека- 0,4-1,2 мг в децилитре крови, в моче- 10-25 в сутки. Повышенное содержание пирувата токсично для организма!

Материал исследования: моча, сыворотка крови.

Реактивы: 2.4- динитрофенилгидразин, 1% р-р в концентрированной соляной кислоте, толуол, гидроксид калия, спиртовой 2,5% р-р, пируват, стандартный р-р (6.25 мг в 100 мл воды).

Оборудование: штатив с сухими пробирками, мерный цилиндр 10 мл, мерные пипетки 1-2 мл с грушей, корковые пробки, обернутые фольгой, ФЭК, кюветы, с рабочей шириной 1 см.

Ход работы:

Готовят 3 пробирки. В первую (опытную) приливают 1 мл мочи (или 1 мл сыворотки), в две другие (контрольные) приливают по 1 мл дистиллированной воды. Во все 3 пробирки добавляют по 0.5 мл 0.1 % р-ра 2.4-динитрофенилгидрозина (осторожно, концентрированная соляная кислота!!!), перемешивают и оставляют стоять на 5 мин.
По истечении этого времени прибавляют с помощью мерного цилиндра по 3 мл толулола в каждую пробирку. Пробирки закрывают пробками, обернутыми в фольгу, встряхивают в течении 3-х мин и оставляют на столе на 2 мин до четкого появления двух фаз: нижняя- вода, верхняя- толуол. Верхний слой отсасывают пипеткой с резиновым колпачком в несколько приемов и переносят в сухую пробирку.
Из собранной жидкости мерной пипеткой отбирают точно 1 мл и переносят в сухую пробирку. Точно также поступают и с двумя контрольными пробами. К содержимому всех трех пробирок приливают по 2 мл спиртового р-ра гидроксида калия с помощью мерного цилиндра. Спустя 10 мин пробы колориметрируют на ФЭКе со светофильтром № 4 в кюветах с толщиной слоя 1 см.

Расчет: Содержание пирувата в пробе определяют по калибровочному графику, а затем для мочи пересчитывают на суточный диурез(умножают на 1500), получая ответ в мг на 1500 мл. Если работу выполняли с сывороткой, производят расчет на 1 л сыворотки. Расчет проводят по формуле х= а*3*1500, где а- содержание пирувата в пробе, мкг; 3- разведение; 1500- суточный диурез.

Оформление работы: В протокол заносят принцип метода, клиническое значение определения пирувата и полученный ответ.

Практическая работа № 7

Тема: Переваривание углеводов в желудочно-кишечном тракте.

Цель: изучения влияния слюны, желудочного сока и пакреатина на полисахариды пищи: крахмал и целлюлозу.

Материал исследования: крахмал, 1% р-р; целлюлоза, 1% водная суспензия.

Реактивы: желудочный сок; панкреатин, 5% р-р; слюна; сульфат меди, 1% р-р; гидроксид натрия, 10% р-р.

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, бюретки, термостат (37 С), газовая горелка.

Ход работы:

Готовят пробы соответственно таблице:

№ пробы	Р-р крахмала, мл	Суспензия целлюлозы, мл	Слюна, мл	Желудочный сок, мл	Панкреатин, мл
	1.0 ---- 1.0 ---- 1.0 ---- 1.0 ----	---- 1.0 ---- 1.0 ---- 1.0 ---- 1.0	1.0 1.0 ---- ---- 1.0 1.0 ---- ----	---- ---- 1.0 1.0 1.0 1.0 ---- ----	---- ---- ---- ---- ---- ---- 2.0 2.0

Для инкубации пробирки помещают в термостат на 30 мин. После инкубации содержимое каждой пробирки анализирует на присутствие продуктов расщепления полисахарида с помощью реакции Троммера. Для этого в каждую из восьми пробирок добавляют 10% р-ра гидроксида натрия и по 5 капель 1% сульфата меди. Осторожно нагревают верхнюю часть р-ра в пробирке до закипания на газовой горелке и кипятят в течении 1 мин. Появление красного осадка оксида меди (I) указывает на положительную реакцию Троммера в присутствии глюкозы и мальтозы.

Оформление работы: Результаты опыта оформляют в виде таблицы:

Номер пробы	Субстрат	Обнаружение продуктов реакции	Фермент, расщепляющий углеводы	Источники фермента	Отдел ЖКТ	Объяснение результатов

Тема: «Открытие молочной кислоты в желудочном соке.»

Реакция Уффельмана:

В пробирку наливают 10-15 капель реактива Уффельмана, приливают равный объем дистиллированной воды и добавляют 3-5 капель желудочного сока. В присутствии молочной кислоты фиолетовое окрашивание реактива Уффельмана переходит в зеленовато-желтое.

Тема: «Использование фосфорной кислоты в процессе брожения.»

Практическая работа № 8

Тема: «Качественная реакция на пентозы (реакция Фелинга).»

Ход исследования: В пробирку наливают 5 капель гидролизата, нейтрализуют его по лакмусу 10% р-ром едкого натра и проделывают реакцию Фелинга

Реакция Фелинга:

Ход исследования: В пробирку вносят 5-6 капель 1 % р-ра глюкозы или другой исследуемой жидкости, добавляют 3-5 капель реактива Фелинга и нагревают. Появляется желтое окрашивание, затем образуется желтый или кирпично-красный осадок.

Тема: «Определение глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидантным методом.»

Биохимический анализатор.

Определение глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидантным методом

Отмерить (мл)	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная проба
Сыворотка крови	0,01
Калибровочный раствор глюкозы		0,01
Вода дист.			0,01
Рабочий раствор	1,00	1,00	1,00

Содержимое пробирок тщательно перемешать и инкубировать в течение 15 минут при температуре 37^о С или в течение 30 минут при комнатной температуре +18-25^о С. через 5-10 минут после начала инкубации пробирки интенсивно встряхнуть. После окончания инкубации измерить величину оптической плотности калибровочный и опытных проб против контрольной пробы при длине волны 510 (470-540) нм в кювете с толщиной поглащающего свет слоя 10 или 5 мм. Окраска устойичива в течение 1 часа после окончания инкубации.

Е о

С = ----------- х 10

Е к

Где

С - концентрация глюкозы в опытной пробе, м моль/л.

Ео- оптическая плотность опытной пробы, ед. опт.плотности.

Ек -оптическая плотность калибровочной пробы ед. опт.плотн.

10- концентрация глюкозы в калибровочном растворе, ммол/л.

Практическая работа №9

Тема: «Выделение гликогена из печени и изучение его свойств.»

В печени человека при нормальном питании запасается 80-120 гр гликогена. При голодании в течении суток почти весь запас гликогена расходуется и его не удается обнаружить обычными качетвеными реакциями.

Материал исследования: Печень сытого животного, печень животного после суточного голодания.

Реактивы: трихлоруксусная кислота, 5% р-р; этиловый спрт; сульфат аммония в порошке; ацитат свинца, 10% р-р; р-р Люголя; физ.р-р.

Оборудование: Аптечные весы и разновес; штативы с пробирками; воронки; стеклянные палочки; бумажные фильтры; ступки; химический стакан; газовые горелки.

Ход работы:

Печень забитых животных быстро извлекают, разрезают на тонкие пласты и опускают в стаканы с кипящим физ. р-ом для инактивации фермента фосфорилазы гликогена. Через 10-15 мин печень извлекают из р-ра. Далее исследование печени сытого и голодавшего животного проводится отдельно.
Отвешивают на весах 0.5 гр печени, помещают в ступку, заливают тремя мл 5% р-ра ТХУ и растирают пестиком в течении 10 мин. Затем прибавляют 3 мл дист воды, суспензию перемешивают и фильтруют через смоченный водой бумажный фильтр в чистую пробирку.
С полученными фильтратами выполняют качественные реакции на гликоген.

А) В одну пробирку наливают 1 мл дист воды, во вторую и третью –по 1 мл фильтратов. После этого в каждую пробирку наливают по 1-2 капли р-ра Люголя и сравнивают окраску.

Б) В 3 пробирки наливают по 10 капель фильтрата, полученного из печени сытого животного, и проделывают реакции осаждения. Для этого в первую приливают 10 капель этилового спирта, во вторую 10 капель 10% ацитата свинца, в 3 насыпают порошок сульфата аммония до полного насыщения.

Оформление работы: Внесите результаты в таблицу; сравните результаты.

Препарат	Спирт	Р-р ацитата свинца	Сульфат аммония
Печень сытого животного Печень голодавшего животного Выводы

Тема: «Определение сиаловых кислот.»

1. Реакция с уксусносернокислотным реактивом.

Ход исследования: В пробирку наливают 5 капель слюны и 20 капель уксусносернокислотного реактива. Хорошо встряхнув, пробирку помещают на 30 мин в кипящую водяную баню, после чего наблюдают оюразование буровато-розового окрашивания.

2. Реакция с дифениламином.

Ход исследования: В пробирку наливают 5 капель слюны, 20 капель дифениламиноваго реактива. После встряхивания помещают пробирку на 30 мин в кипящую водяную баню. Содержимое окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

Практическая работа № 10

Тема: «Определение глюкозы в сыворотке крови и моче.»

Цель: Освоить методику определения глюкозы в сыворотке крови и моче, уметь объяснить полученные результаты. Освоить метод глюкозо-толерантного теста.

Задачи обучения: Знание материала этих тем является основополагающим для изучения функциональной биохимии. Освоив методику определения глюкозы в сыворотке крови и моче, закрепить теоретические знания на практике при обсуждении полученных результатов и написании выводов работ.

1. ГЛЮКОЗОТОЛЕРАНТНЫЙ ТЕСТ

Определение уровня глюкозы в крови через определенный промежуток времени после нагрузки глюкозы дает более ценные данные о состоянии углеводного обмена, чем однократное исследование количества глюкозы в крови натощак. У взрослых эта проба производится следующим образом. С утра у больного натощак определяют уровень глюкозы в крови, после чего дают принять глюкозу от 1 до 1,5 грамма глюкозы на 1 кг веса с небольшим количеством воды. Повторно исследуют количество глюкозы в крови на 15-й, 30-й,60-й,90-й,120-й,180-й,240-й минуте. На основании полученных данных строят график, откладывая на оси ординат количество глюкозы в крови в ммоль/л, а на оси абцисс - время взятия пробы. У взрослых людей уровень глюкозы в крови после нагрузки глюкозой изменяется следующим образом:1. Через 30-60 минут после приема глюкозы наблюдается максимальный уровень глюкозы в крови - на 35 и на 80 % выше исходного. Повышенное количество глюкозы в течений первого часа после приёма глюкозы объясняется переходом глюкозы в кровь и в значительной мере зависит от быстроты всасывания, в частности от состояния слизистой оболочки кишечника.

2. После нагрузки глюкозой, уровень глюкозы в крови снижается, к 120-й минуте и может снизиться до более низкого уровня, чем до приема глюкозы. Снижение количество глюкозы в крови в этом периоде объясняется усиленным выделением инсулина из поджелудочной железы в ответ на увеличение содержания глюкозы в крови после приемы глюкозы. При этом обыкновенно выделяется немного больше инсулина, чем это требуется для восстановления нормального уровня глюкозы в крови, что приводит к небольшой гипогликемии.

3.К 150-180 -й минуте уровень глюкозы в крови возвращается к исходному. В норме нагрузка глюкозой, как правило не вызывает глюкозурию.

Гликемические кривые отличаются от нормы при сахарном диабете, повреждении паренхимы печени, гиперфункции щитовидной железы, коры надпочечников, тяжелых анемиях, заболеваниях центральной нервной системы, инфекционных заболеваниях, токсических состояниях.

2.Ферментативное определение глюкозы в сыворотке крови

Глюкоза в присутствии глюкозооксидазы окисляется до глюконовой кислоты и перекиси водорода. Образующаяся перекись водорода при катализе переоксидазой реагирует с фенолом и 4-аминоанитипирином, образуя окрашенный хинонимин. Интенсивность розово-красного окрашивания пропорциональна концентрации глюкозы.

Длина волны - 500, 546 нм

	Реагент бланк	Стандарт (калибратор)	Сыворотка крови
Реагент R1	1,00 мл	1,00 мл	1,00 мл
Сыворотка крови	-	-	0,01 мл
Стандарт (калибратор)	-	0,01 мл	-
Дистиллированная вода	0,01 мл	-	-
Смешать инкубировать 10 мин при 37 ^о С или 20 мин при 20-25^о С. Измерить поглощение образца А _обр и стандарта (калибратора) А _кал относительно бланка. Стабильность окраски 1 час.

Определение в капиллярной крови с депротеинизацией

	Стандарт (калибратор)	Сыворотка крови
Хлорная кислота (0,33 моль/л)	1,00 мл	1,00 мл
Сыворотка крови	-	0,10 мл
Стандарт калибратор	0,10 мл	-
Смешать в пробирках, отцентрифугировать при 3000g, отделить прозрачный супернатант.
	Реагент бланк	Стандарт калибратор	Сыворотка крови
Реагент R1	1,00 мл	1,00 мл	1,00 мл
Сыворотка крови	-	-	0,10 мл
Стандарт (калибратор)	-	0,10 мл	-
Дистиллированная вода	0,10 мл	-	-
Смешать инкубировать 10 мин при 37^о С или 20 мин при 20-25^о С измерить поглощение образца А _обр и стандарта (калибратора) А _кал относительно бланка. Стабильность окраски 1 час.

Расчет

А сыворотка крови - А бланк

Глюкоза моль/л = --------------------------- х С кал

А кал - А бланк

С кал = концентрация стандарта калибратора

Нормальные величины:

Глюкоза ммоль/л

Дети: От рождения до 1 месяца - 1,7-4,4, 2 месяца - 3,3,-5,8

Взрослые: сыворотка плазма - 4,2-6,0

Капилярная кровь - 3,9-5,6, Моча (моль/ 24 часа) - 0,0-1,7

Практическая работа №11

Тема: «Определение свободных жирных кислот в сыворотке крови.»

В крови содержание свободных жирных кислот 640 – 880 мкмоль/л.

Принцип метода. Медные соли жирных кислот способны образовывать с диэтилдитиокарбаматом натрия окрашенные комплексные соединения, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации свободных жирных кислот.

Ход работы. В опытную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови, затем приливают 5 мл хлороформа и добавляют 2,5 мл медного реактива. Контрольную пробу готовят параллельно: к 5 мл хлороформа добавляют 2,5 мл медного реактива. Пробирки закрывают пробками и встряхивают в течении 3 мин. Содержимое переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 об/мин в течении 15 мин. Смесь в пробирках разделяется на три слоя: хлороформ, белок и вода. Верхнюю водную фазу, содержащую избыток медного реактива, удаляют, белковую пленку сдвигают на стенки пробирок, а хлороформный слой переносят в пробирки. К хлороформному слою с экстрагированными в нем жирными кислотами добавляют 0,5 мл 0,1 % диэтилдитиокарбаната натрия в бутаноле и перемешивают содержимое пробирок. Опытную пробу колориметрируют на ФЭК с синим светофильтром в кюветах на 5 мл против контрольной пробы. Содержимое свободных жирных кислот рассчитывают по калибровочному графику.

Клинино-диагностическое значение. Концентрация свободныхнеэстерифицированных жирных кислот в сыворотке крови увеличивается при сахарном диабете, после введения адреналина, при голодании, поскольку идет мобилизация жира из жирового депо, и свободные жирные кислоты транспортируются в комплексе с альбуминами. Уменьшается содержание свободных жирных кислот в сыворотке крови после введения инсулина и глюкозы.

Тема: «Количественное определение активности липазы в присутствии желчи.»

Об активности фермента липазы судят по количеству жирных кислот, образовавшихся за определенный промежуток времени в результате гидролиза триглицеридов.

Ход работы: В 2 узких стаканчика отмеривают по 5 мл прокипяченного молока и по 2 мл вытяжки из поджелудочной железы. Затем в 1 стаканчик добавляют2 мл 5% р-ра желчи, а во в торой- 2мл дист воды. После перемешивания жидкости из каждого стаканчмка в колбочке отбирают пробы по 1 мл, а стаканчики помещают в водяную баню (38-40 С). К пробам добавляют по 2 капли 0.1 % спиртового р-ра фенолфталииина и по 3 мл дист воды, а затем жидкости титруют 0.05 н. р-ом едкого натра до розовой окраски. Последующие пробы по 1 мл жидкости из стаканчиков берут через 15, 30, 45 и 60 мин и,добавив по 2 капли р-ра фенолфталиина и по 3 мл дист воды, титруют тем же р-ом едкого натра до розовой окраски в жидкости в колбочках. Кол-во мл 0.05 н р-ра едкого натра, израсходованного на титрование каждой пробы, записывают в таблицу, а затем наносят на график и вычерчивают кривые, характеризующие активность фермента липазы.

Номер пробы	Время взятия пробы	Кол-во мл 0.05 н р-ра едкого натра, израсходованного на титрование Стаканчик№1 Стаканчик№2
	До начала гидролиза Через 15 мин 30 мин 45мин 60 мин

Практическая работа №12

Принцип метода

Триглицериды пробы образуют в результате сопряженных реакций, описанных ниже, цветной комплекс, который может быть измерен спектрофотометрически 1,2

липиза

Триглицериды + Н2О ___________ глицерол + жирные кислоты

глицеролкиназа

Глицерол + АТР ____________ глицерол 3-Р+ADP

G3P - оксидаза

Глицерол 3 Р+О2 ____________ дигидроксиацетон Р+Н2О2

пероксизада

2Р2О2+4 Аминоатипирин+4 хлорфенол ____________ хинонимин + 4 Н2О

Процедура

Подогреть реагенты до комнатной температуры
Разлить в промаркированные пробирки
Тщательно перемешать и инкубировать 15 минту при комнатной температуре 16-25 С или 5 минут при 37 С
Измерить абсорбцию А ст андарт и образца при 500 нм против холостой пробы. Окраска раствора стабильна меннее 2 часа

	Холостая проба	Стандарт	образец
Стандартная тг	-	10 мкл	-
Образец	-	-	10 мкл
Реагент А	1,0 мл	1,0 мл

Расчет

А Образца

------------------- х с стандарта = С образца

А стандарта

Если для калибровки используется постаяляемый стандарт триглицеридов

А образца х 200 = мг/ дл триглицеридов

---------------

А стандарта х 2,26= моль /л триглицеридов

Нормальные значения

150 мг/дл = 1,7 ммоль/л

150-199 мг/дл = 1,70-2,25 ммоль/л

240-499 мг/дл =5,64 ммоль/л

500 мг / дл = 5,65 ммоль/л

Триглицериды – эфиры глицерола и жирных кислот, поступающие с пищей или синтезированные в печени. Триглицериды транспортируются в плазму липопротеинами и используются в жировой ткани, мышцах и т.д. Главная функция триглицеридов обеспечение энергией клетки.

Повышение уровней триглицеридов в сывортке крови может быть вызвано заболеваниями печени, сахарным диабетом, нефрозом, гипотироидизмом, алкоголизмом.

Принцип электрофоретического разделения молекул состоит в их движении с различной скоростью в постоянном электрическом поле. Наиболее часто в клинической практике используется электрофорез на поддерживающих средах-носителях – хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозных мембранах, различных гелях, а также на комбинированных средах. Электрофорез в агарозном, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле дает существенно лучшие результаты, позволяя идентифицировать большее количество белковых фракций сыворотки (до 30), но и ему присущи недостатки – сложность приготовления геля или дороговизна готовых гелевых пластин.

Знак и величина электрического заряда молекул белков сыворотки крови, а значит, направление и скорость их движения при электрофоретическом разделении, зависят от значения рН и ионной силы среды. Кроме того, скорость движения белковых молекул определяется их молекулярной массой, ионным окружением (составом и концентрацией буфера), приложенным напряжением и другими факторами. В связи с этим для получения сопоставимых данных электрофорез должен осуществляться при строго определенных значениях указанных параметров. В буферном растворе с рН=8,6 или 8,9 и ионной силой 0,08–0,15 моль/л все белки сыворотки крови приобретают отрицательный заряд и движутся от катода к аноду, причем дальше всего уходят альбумины, имеющие меньшую молекулярную массу, затем располагаются a₁-, a₂-, β- и g-глобулины. Иногда каждая из этих основных фракций может разделиться на несколько подфракций.

Сыворотку крови для исследования лучше брать свежей, хранившейся не более нескольких часов. В пробе не должно быть следов гемолиза; в противном случае свободный гемоглобин и его комплекс с гаптоглобином могут образовать дополнительные полосы в области a₂- и β -глобулинов. В присутствии ионов кальция и под влиянием некоторых лекарственных веществ возможно расслоение b-фракции на две подфракции, что объясняется нарушением подвижности С₃-компонента комплемента. Наконец, в целом качество «картинки» зависит от навыков нанесения пробы (это тоже определенное искусство, формирующееся практикой) и используемых инструментов-аппликаторов.

Реактивы, оборудование и исследуемый материал:

Агарозный гель, буфер ТВЕ (Tris-Borate-EDTA), бромистый этидиум, краситель кумасси, уксусная кислота, спирт этиловый, источник тока, ячейка электрофореза, микродозатор, разные носадки, штатив для насадок, штатив для микродозатора.