Физико-химические свойства белков

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению УФ-лучей при 280 им (это свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).
Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Растворы белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского-Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и последние появляются в моче.

Денатурация белков
Под денатурацией следует понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при нагревании их растворов выше 50 60 С.
Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов» увеличению количества свободных функциональных SH-гpyпп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной).

Изоэлектрическая и изоионная точки белков
В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотерными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поте Зная аминокислоты и состав белка, можно приближенно определить изоэлектрическую точку (pI), pI является характерной константой белков. Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности, величина pi пепсина (фермент желудочного сока) равна 1, а сальмина (основной белок из молоки семги) почтя 12. В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. И то электрическая точка белка в сильной степени зависят от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.
В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посторонних ионов обычно его раствор пропускают через колонку, наполненную смесью анионо- и катионообменников. Изоиоиной точкой данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

[Н]+ + [P]*Z=[OH]
где [P] — молярная концентрация белка; Z-средний заряд молекулы. Согласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концентрации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда pi равно 7, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

СТРУКТУРЫ БЕЛКА

Первичная структура — обеспечивается ковалентными пептидными связями.
Вторичная структура — регулярное размещение сегментов остова полипептидной цепи без учета конформации боковых цепей аминокислотных остатков. Известны три типа вторичной структуры: α-спираль, β-складчатый слой и беспорядочный клубок. α-Спираль — это спиральное строение в виде винтовой лестницы, где каждая ступень — определенная аминокислота. Витки спирали соединены
между собой непрочными водородными связями. Обеспечивается водородными связями — С=О...H-N—,
возникающими между карбонильным кислородом и иминным азотом, принадлежащим к той же самой полипептидной цепи.
В β-складчатом слое 2 или более полипептидных цепи; сложены зигзагом так, что их сегменты находятся вблизи друг от друга в параллельной или антипараллельной ориентации, причем соседние сегменты соединены водородными связями. Беспорядочный клубок — участки, которые нельзя отнести ни к α-спирали, ни к β-складчатому слою.
Третичная структура — расположение всех ковалентно связанных атомов данной полипептидной цепи в пространстве без учета взаимодействия с другими субъединицами. В формировании третичной структуры, помимо первичной и вторичной, участвуют дисульфидные, ионные водородные, вандер-ваальсовы и гидрофобные взаимодействия, обусловленные неполярными боковыми группами пептидных цепей. Аминокислотная последовательность во внешних α-спиралях часто характеризуется периодичностью. Каждое третье или четвертое положение в них занимает аминокислота с неполярными боковыми группами, направленными внутрь глобулы, а остальные, как правило, полярны и обращены в сторону водной среды.
У крупных белков может быть промежуточный уровень организации – домены. Домены – фрагменты полипептидной цепи, сходные по своим свойствам с самостоятельными глобулярными белками.
Четвертичная структура – имеется только у белков, содержащих две или более пептидных цепи, которые образуются за счет слабых взаимодействий единую функционально активную белковую молекулу. Поэтому под четвертичной структурой подразумевают размещение субъединиц в пространстве со всей совокупностью контактов между ними.

Цветные реакции на белки:
1.Биуретовая реакция (Пиотровского)
Реакция обусловлена наличием в белках пептидных связей — C — N — соединяющих остатки
аминокислот в молекуле белка путем отнятия элементов частицы воды из —СООН группы одной аминокислоты и—NH2 группы другой:

В сильно щелочной среде в присутствии сернокислой меди образуются комплексные соединения меди с пептидной группировкой, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.
Биуретовой реакцией обнаруживаются все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза — пептоны и полипептиды. Для ди- и трипептидов биуретовая реакция ненадежна. Оттенок окрашивания зависит от длины пептидной цепочки. Пептоны при этой реакции дают розовое или красное окрашивание. Биуретовая реакция положительна и с веществами небелкового характера, имеющими в своем составе не менее двух — СО — NH2 — групп, к ним относятся, например, оксамид — H2N — СО — СО—NH2, биурет—H2N—СО—NH—СО—NH2, по которому и названа реакция.
Ион меди является центральным атомом фиолетового окрашенного комплекса, который образуется только в присутствии пептидных связей или двух групп — СО—NH2. Так как биуретовая реакция протекает в сильно щелочной среде, образуются анионные комплексы:
В тех же условиях аминокислоты присоединяют ионы меди Cu2+ по типу хелатов без образования окрашенных комплексов:

2.Реакция Миллона
Реактив Миллона состоит из азотнокислых солей окиси и закиси ртути в HN03 с примесью HNO3. Он дает окрашивание с фенолами, полифенолами. В случае белков реакция обусловлена присутствием в них тирозинового остатка со свободной фенольной группой.
При нагревании раствора белка с реактивом Миллона образуется нитросоединение тирозина, которое, присоединяя ртуть, превращается в ртутную соль нитротирозина, имеющую пурпурно-красный цвет:
Белки, не содержащие тирозина (желатина, клупеин, сальмин и др.), не дают реакции Миллона.

3.Ксантопротеиновая реакция (Мульдера)
Реакция обусловлена наличием в белке циклических аминокислот — тирозина и триптофана, содержащих в своем составе бензольное ядро. При нагревании большинства белков с концентрированной азотной кислотой бензольное ядро тирозина и триптофана нитруется с образованием нитро-производных желтого цвета. Последние при добавлении щелочи превращаются в соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет.
Реакцию нитрования и образования солей хиноидной структуры можно представить следующим образом.

Ксантопротеиновую реакцию (желтое окрашивание) можно наблюдать на коже, ногтях, шерсти и т. п. при попадании на них концентрированной азотной кислоты. По-гречески «ксантос»— желтый, откуда реакция и получила название. Белки, не содержащие тирозина и триптофана, не дают ксантопротеиновой реакции (желатина, клупеин, сальмин и др.). В отличие от тирозина и триптофана фенилаланин подвергается нитрованию с большим трудом и, по-видимому, не обуславливает ксантопротеиновой реакции. Поскольку ксантопротеиновая реакция обусловлена нитрованием ароматического кольца, она может быть положительной с более простыми ароматическими соединениями, например с фенолом.

4.Реакция Адамкевича.
Реакция обусловлена присутствием в белке остатков аминокислоты триптофана. Она основана на способности триптофана в кислой среде вступать в реакцию с глиоксилевой кислотой, образуя при этом окрашенные продукты конденсации. В качестве источника глиоксилевой кислоты обычно используют ледяную уксусную кислоту, содержащую примесь глиоксилевой. Две молекулы триптофана, реагируя с глиоксилевой кислотой, образуют соединение красно-фиолетового цвета:

5.Реакция Шульце-Распайля
Данная реакция обусловлена наличием в белке остатка триптофана. Триптофан, взаимодействуя с оксиметилфурфуролом, дает продукты конденсации, окрашенные в вишнево-красный цвет. Окси-
метилфурфурол в этой реакции образуется из гексоз (быстрее из фруктозы), получающихся при гидролизе сахарозы под влиянием концентрированной серной кислоты.
Образование окси метил фурфурол а из фруктозы в присутствии концентрированной серной кислоты происходит в результате следующей реакции:

6.Реакция Фоля
Реакция обусловлена присутствием в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. Эти аминокислоты под влиянием щелочи при нагревании разрушаются с образованием сероводорода. Последний в щелочной среде дает сернистый натрий, который, реагируя с плюмбитом натрия, образует черный осадок сернистого свинца:

Плюмбит натрия получается в процессе реакции при взаимодействии уксуснокислого свинца со щелочью:
(CH3COO) 2Pb + 2NaOH Pb (OH) 2+2CH3COONa
Pb (OH) 2 + 2NaOH^ Pb (ONa) 2+ 2H20
Другая серусодержащая аминокислота метионин более устойчива и при слабом щелочном гидролизе не разрушается.

7.Проба с нитропруссидом натрия
При кипячении белка со щелочью аминокислоты, содержащие серу, разрушаются с образованием сернистого натрия. При взаимодействии сернистого натрия с нитропруссидом натрия образуется комплексная соль красно-фиолетового цвета:
Na2S + Na[Fe(CN)5NO] → Na4[Fe(CN)5NOS]

8.Реакция Сакагучи
Данная реакция дает положительный результат с веществами, содержащими гуанидиновую группировку, и указывает на присутствие в молекуле белков остатков аргинина.
При взаимодействии аргинина в щелочной среде с гипобромитом (бромноватисто-кислым натрием) и а-нафтолом образуется соединение красного цвета, представляющее собой продукт конденсации окисленного аргинина с а-нафтолом. Роль окислителя играет гипобромит. Окислению подвергается гуанидиновая группа аргинина.

9.Диазореакция (реакция Паули)
Реакция обусловлено присутствием в белке гистидина и тирозина. Эти аминокислоты с диазореактивом в щелочной среде дают оранжево-красное окрашивание. В состав диазореактива входят сульфаниловая кислота, азотистокислый натрий и соляная кислота. При их взаимодействии происходит ди азотирование сульфаннловой кислоты с образованием диазобензосульфокислоты:

Диазобснзосульфокислота реагирует с гистидином (или тирозином), при этом получается азокраситель оранжево-красного цвета:

Диазореакция используется для качественного и количественного определения гистидина и тирозина в белковых гидролизатах и других объектах. Она не является строго специфичной. Её дают вешества, имеющие в своей структуре фенольное, имидазольное, пиррольное или тиазоловое кольцо (адреналин, тиамин, карнозин, желчные пигменты, гнетами и и другие вещества).

10.Нингидриновая реакция
Реакция обусловлена наличием в белке остатков а-аминокислот. При нагревании растворов белка, пептидов и а-аминокислот с нингидрином образуются окрашенные соединения.
Нингидрин, являясь сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование а-аминокислоты, приводящее к образованию аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина:

Восстановленная форма нингидрина реагирует с избытком нингидрина и с аммиаком. При этом образуется продукт конденсации сине-фиолетового цвета:

В случае аминокислот (пролина и оксипролина) образуется продукт ярко-желтого цвета. Нингидриновую реакцию дают некоторые амины, амиды кислот, а также аммонийные соли и др. соединения.

Простые и сложные белки
Простые белки построены из остатков аминокислот и при гидролизе распадаются соответственно только на свободные аминокислоты.
Сложные белки -это двухкомпонентные белки, которые состоят из какого-либо простого белка и небелкового компонента, называемого простетической группой. При гидролизе сложных белков, помимо свободных аминокислот, освобождается небелковая часть или продукты ее распада.
Простые белки в свою очередь делятся на основании некоторых условно выбранных критериев на ряд подгрупп: протамины, гистоны, альбумины, глобулины, проламины, глютелины и др. Классификация сложных белков основана на химической природе входящего в их состав небелкового компонента. В соответствии с этим различают фосфопротеины (содержат фосфорную кислоту), хромопротеины (в состав их входят пигменты), нуклеопротеины (содержат нуклеиновые кислоты), гликопротеины (содержат углеводы), липопротеины (содержат липиды) и металлопротеины (содержат металлы).

ХИМИЯ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ

Протамины и гистоны. Данная группа белков отличается рядом характерных физико-химических свойств» своеобразием аминокислотного состава и представлена в основном белками с небольшой молекулярной массой. Протамины обладают выраженными основными свойствами, обусловленными наличием в их составе от 60 до 85% аргинина.Так, сальмии, выделенный из молок семги, состоит на 85% из аргинина. Высоким содержанием аргинина отличается другой хорошо изученный белок — клупеин, выделенный из молок сельди: из 30 аминокислот в нем на долю аргинина приходится 21 остаток. Расшифрована первичная структура клупеина. Протамины хорошо растворимы в воде, изоэлектрическая точка их водных растворов находится в щелочной среде. По современным представлениям, протамины скорее всего являются пептидами, а не белками, поскольку их молекулярная масса не превышает 5000. Они составляют белковый компонент в структуре ряда сложных белков.

Гистоны также являются белками основного характера. В их состав входят лизин и аргинин, содержание которых, однако, не превышает 20-30%. Молекулярная масса гистонов намного больше нижнего предела молекулярной массы белков. Эти белки сосредоточены в основном в ядрах клеток в составе дезоксирибонуклеопротеинов и играют важную роль в регуляции экспрессии генов.

Проламины и глютелины. Это белки растительного происхождения, отличаются своеобразием аминокислотного состава и физико-химических свойств. Они содержатся в основном в семенах злаков (пшеница, рожь, ячмень и др.), составляя основную массу клейковины. Характерной особенностью проламинов является растворимость в 60-80% водном растворе этанола, в то время как все остальные простые белки в этих условиях обычно выпадают в осадок. Наиболее изучены оризенин (из риса), глю гении и шил дм и (из пшеницы), зеин (из кукурузы), гордеин (из ячменя) и др. Установлено, что проламины содержат 20-25% глутаминовой кислоты и 10-15% пролина.
Альбумины и глобулины. Эти белки относятся к белкам, широко распростри пенным в органах и i канях животных. Наиболее богаты ими белки сыворотки крови, молока, яичный белок» мышцы и др. В плазме крови человека в норме содержится около 7% белков, представленных преимущественно альбуминами и глобулинами. Альбумины и глобулины — это глобулярные белки, различающиеся по растворимости.