Варіанти хроматографії за фазовим станом

Физико-хімічні властивості білків

Молекулярна маса розчинність амфотерність електричний заряд, ізоелектрична точка здатність до осадження

• Молекулярна маса білків знаходиться в межах від 5000 до декількох мільйонів. Визначається методом седиментації (за швидкістю осадження в ультрацентрифузі), фільтрацією гелю, електрофорезом.

• Розчинність (гідрофільність).

У молекул білка на поверхні є вільні іоногенні групи (-СООН -NH2, - SH) амінокислот лізину, аргініну, глутамінової, аспарагінової кислот, цистеїну і ін. При розчиненні у воді вони утворюють іони, які притягають диполі води. Така орієнтація Н2О навколо молекул білка називається гідратною оболонкою.

Стабільність молекул білка в розчині визначається:

• Зарядом молекул білка

• Гідратною оболонкою

• Заряд білкових молекул залежить від співвідношення вільних - СООН і NH2 - груп (тобто кислих і лужних амінокислот) і від рН середовища.

Такий стан білка, при якому він не має заряду, називається ізоелектричним станом. рН середовища, при якому білок електронейтральний, називається ізоелектричною точкою білка. При цьому білок нестабільний в розчині, легко випадає в осад. Ізоелектрична точка кислих білків (більше за СООН - груп) знаходиться при рН менше 7,0, а лужних - при рН більше 7,0. Білки крові кислі, а рН крові 7,36 - 7,40, тому вони мають негативний заряд.

• Для альбумінів це рН - 4,7

• Для глобулінів - рН - 6,5

• При рН нижче за ізоелектричну точку білок набуває заряд «+». При рН вище за ізоелектричну точку - заряд «-».

• Буферна функція білків означає, що білки здатні підтримувати рН середовища, тобто нейтралізувати надлишок кислоти і лугу. Така властивість білків, коли вони можуть проявляти в кислому середовищі властивості лугу, а в лужній властивості кислоти називається амфотерністю.

Осадження

Оборотнє

Необоротнє

• Приклад оборотного осадження: висолювання (осадження високими концентраціями нейтральних солей сульфату амонію (NH4)2SO4, NaCl і ін. При цьому відбувається конкуренція між молекулами білка і солі за воду.

• Білок від солі можна відокремити методом діалізу (використовують напівпроникну оболонку, через яку проходять тільки молекули солі).

Необоротне осадження - денатурація. Відбувається при дії високої температури, сильних кислот, солей важких металів, алкалоїдів, ультразвуку, радіації, високого тиску. При цьому білок втрачає свою нативну структуру, (окрім первинної), біологічні властивості.

Денатурація використовується в медичній практиці:

• При визначенні білка в сечі (осадження кислотами), при стерилізації інструментів, перев'язувального матеріалу, хірургічного одягу (температура, тиск), білок використовують як антидот при отруєнні солями важких металів (молоко, білок яєць), алкалоїдні реактиви використовуються як терпкі засоби при захворюваннях шлунку, кишечника, опіках і т.д.

 

5 Білкова молекула містить міцні ковалентні й відносно слабкі нековалентні зв'язки. Таке поєднання ковалентних і нековалентних зв'язків надає білковій молекулі певної міцності і рухомості у процесі функціонування.

Ковалентні зв'язки в білковій молекулі представлені пептидним і дисульфідним зв'язками. Пептидний, або кислото-амідний, зв'язок (-СО-NH-) є типовим ковалентним зв'язком, за допомогою якого залишки амінокислот

з'єднуються між собою, утворючи скелет білкової молекули. Важ лива роль у стабілізації просторової структури білкової молекули належить дисульфідному зв'язку (-S-S-). Він утворюється внаслідок окиснення сульфгідрильних груп двох залишків цистеїну в поліпептидному ланцюзі (або в двох ланцюгах).

До нековалентних зв'язків і взаємодій, що впливають на просторову структуру та функціональну динамічність білкової молекули, належать: гідрофобна взаємодія, електростатичні (іонні) та водневі зв'язки. Гідрофоб-

на взаємодія виникає при наближенні гідрофобних вуглеводневих і ароматичних радикалів деяких амінокислот (аланін, валін, лейцин, ізолейцин, фенілаланін, триптофан). При гідрофобній взаємодії аполярні групи

амінокислот, що входять у склад поліпептидного ланцюга (-СН3, С2Н5,гідрофобна взаємодія С6Н5), прагнуть вийти з води в гідрофобну ділянку, утворювану за рахунок зближення та об'єднання цих груп. Внаслідок такої взаємодії аполярні групи виявляються у внутрішній а гідрофільні розташовуються на поверхні і контактують із водою.

Водневий зв'язок виникає між ковалентно зв'язаним атомом водню,що має невеликий позитивний заряд, сусіднім атомом, що має незначний негативний заряд. У білковій молекулі цей зв'язок найчастіше встанов-

люється між двома пептидними групами (NH C O...HN C O), між карбоксильною і гідроксильною група (наприклад, серину або треоніну) (C O...H O C H 2...), між фенольним (тирозин) і імідазольним (гістидин) залишками.

Первинна структура білків

Первинна структура білка вказує на якісний та кількісний склад амінокислот і порядок їх розміщення у білковій молекулі. Інакше кажучи, під первинною структурою розуміють найпростіший рівень структурної організації білкової молекули. Він має вигляд поліпептидного ланцюга, побудованого із залишків амінокислот, між якими існують пептидні зв'язки Ці зв'язки впливають не тільки на форму первинної структури, але і

на вищі рівні організації поліпептидного ланцюга. Атоми, що утворюють пептидну групу, характеризуються рядом особливостей:

1. Усі атоми, які входять у пептидну групу, знаходяться в одній площині.

2. Відносно С-N-зв'язку атоми кисню і водню в пептидній групі займають трансположення.

3. Атоми водню і кисню групи -СО-NH- можуть утворювати два водневі зв'язки з іншими групами, зокрема пептидними.

4. Пептидні групи, що відзначаються жорсткістю (всі атоми мають обмежену здатність виходити з однієї площини), чергуються в поліпептидному ланцюзі з відносно рухомими ділянками (-СНR), що здатні обертатись навколо зв'язків.

 

Вторинна структура

Поліпептидний ланцюг не лежить в одній площині. Внаслідок взаємодії між повторюваними структурними компонентами та залишками амінокислот ланцюг набуває певної просторової структури(конформації). У білках розрізняють два рівні конформації пептидних ланцюгів – вторинну і третинну структури. Вторинна структура являє

собою просторово впорядковану конфігурацію (форму) поліпептидного ланцюга. В основі укладки ланцюга в упорядковану структуру важлива роль належить двом чинникам:

1) псхильність -СОNH-груп до утворення із сусідніми групами і водневих зв'язків із метою забезпечення структурі мінімуму вільної енергії або максимуму водневих зв'язків;

2) пептидний зв'язок утворює структуру, всі атоми якої знаходяться в одній площині.

Внаслідок цього повороти атомів навколо нього загальмовані порівняно з іншими типами

зв'язків (N-Cα i C-Cα).Внаслідок таких обмежень при утворенні пептидних зв'язків ланцюг

набуває не довільної, а певної, структурно впорядкованої, конформації. Зараз виділяють 3 типи вторинної структури: α-cпіральна, β-складчаста та колагенова спіраль.

Третинна структура білка

Під третинною структурою білка розуміють форму упаковки білкової

молекули в просторі. За формою третинної структури білки діляться на

глобулярні й фібрилярні. Глобулярні білки мають еліпсоїдну форму, а

фібрилярні – видовжену (палички, нитки). Більшість білків у нативному

стані має компактну структуру. Які сили сприяють формуванню

третинної структури білка? Доведено, що у формуванні просторової

структури білків, крім ковалентних зв'язків (пептидні й дисульфідні),

основну роль відіграють так звані нековалентні зв'язки: водневі, іонні,

вандерваальсові сили, гідрофобна взаємодія та інші. За сучасними даними,

інформація для утворення третинної структури закладена генетично в

первинній структурі. Рушійною силою для утворення тривимірної

структури білка є взаємодія амінокислот із молекулами води. За цих

умов неполярні (гідрофобні) радикали таких амінокислот, як лейцин,

ізолейцин, фенілаланін, триптофан, виштовхуються з води і занурюються

всередину білкової молекули. Разом із тим, полярні, або іоногенні,

радикали (особливо аспарагінової і глутамінової кислот, аргініну і лізину)

розміщуються на зовнішній поверхні молекули і перебувають у

гідратованому стані.

Четвертинна структура білків

Білки, що складаються з одного поліпептидного ланцюга, мають тільки третинну структуру. До них відносять міоглобін – білок м'язової тканини, що зв'язує кисень; ферменти – пепсин, трипсин, лізоцим та ін.

Але є ряд білків, які побудовані з декількох поліпептидних ланцюгів, кожен з яких має третинну структуру. Наприклад, основний білок еритроцитів гемоглобін побудований із чотирьох пептидних ланцюгів – два ланцюги

α i два ланцюги β. Будова такого білка представлена формулою 2α2β. Про такі білки кажуть, що вони мають четвертинну структуру. Іншими словами, четвертинна структура являє собою організацію декількох поліпептидних ланцюгів із третинною структурою в єдину функціональну молекулу білка. Білки, що мають четвертинну структуру,

називаються олігомерами, а їх поліпептидні ланцюги з третинною структурою – протомерами, або субодиницями. Білки з молекулярною масою, більшою 50000, майже завжди є олігомерними. Кількість протомерів,

що входять у склад олігомерних білків, може сягати десяти і навіть більше, але найчастіше зустрічаються димери і тетрамери. Протомери бувають ідентичні або різні.

4 Хроматографія (з грецьк. хромо -колір, графо -пишу) – високоефективний фізико-хімічний метод розділення і аналізу, в якому речовина розподіляється між двома фазами: рухомою і нерухомою.

Варіанти хроматографії за фазовим станом

• Газова хроматографія (використовується наприклад для визначення якості харчового спирту)
• Рідинна хроматографія (використовується для аналізу та виділення органічних сполук)
• Хроматографія над критичними рідинами/газами (рідкісний вид, проміжний між першими двома. Найчастіше використовують як елюєнт вуглкислий газ під високим тиском та підвищених температурах)