Ионнообменнаяхроматография

Ионообменная хроматография – метод разделения, анализа и физико-химического исследования веществ, основанный на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой и компонентами разделяемой смеси. Применяется в основном при неорганическом анализе. Этот широко распространенный в настоящее время метод был разработан в 1947 году, когда Т.Б. Гапон, Е.Н. Гапон и Ф.М. Шемякин впервые осуществили хроматографическое разделение смеси ионов в растворе, которое было объяснено ими обменом ионов сорбентов на ионы из раствора

Ионообменная хроматография, являющаяся разновидностью жидкостной хроматографии, основана на эквивалентном обмене ионов раствора на ионы твердой фазы.

Неподвижной фазой в ионообменной хроматографии являются ионообменники: катиониты (слабо- и сильнокислотные) и аниониты (слабо- и сильноосновные).

Основные хроматографические разделения с применением ионообменников проводят в водных растворах, смешанных растворителях (вода — метанол) или в водных буферных растворах.

Ионообменная хроматография широко используется для решения многих биохимических проблем в научных исследованиях.

Для практических целей ионообменную хроматографию наиболее широко используют для анализа аминокислот. Особенно широкую популярность ионообменная хроматография аминокислот получила с появлением аминокислотных анализаторов, позволяющих автоматизировать почти все стадии анализа за исключением подготовки пробы.

Основы метода

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному обмену противоионов, расположенных в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядам, разделяются на анионитах или на катеонитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами. Амфотерные (биполярные) иониты содержат в своей матрице и катионные и анионные обмениваемые группы. Эти иониты способны образовывать внутренние соли, которые диссоциируют в контакте с электролитами и связывают оба их компонента. Амфотерные иониты легко регенерируются водой.

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии используют ионные растворы (водные растворы солей, кислот и оснований), т.е. системы растворителей, имеющих высокое значение диэлектрической проницаемости и способность ионизировать соединения. Обычно работают с буферными растворами, поддерживающими определенные значения рН.

При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступать во взаимодействие с противоположно заряженными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообменную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом ионизированы.

Ионообменная хроматография целесообразна при разделении высокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом ГЖХ. К таким соединениям относятся аминокислоты, пептиды, гетероциклические основания, углеводы. Ионообменную хроматографию широко применяют в медицине, биологии, биохимии, для контроля окружающей среды, при анализе содержания лекарств и их метаболитов в крови и моче, ядохимикатов в пищевом сырье, а также для разделения неорганических соединений, в том числе радиоизотопов, лантаноидов, актиноидов и др. Анализ биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и др.), на который обычно затрачивали часы или дни, с помощью ионообменной хроматографии проводят за 20–40 мин с лучшим разделением. Применение ионообменной хроматографии в биологии позволило наблюдать за образцами непосредственно в биосредах, уменьшая возможность перегруппировки или изомеризации, что может привести к неправильной интерпретации конечного результата. Интересно использование данного метода для контроля изменений, происходящих с биологическими жидкостями. Применение пористых слабых анионообмеников на силикагелевой основе позволило разделить пептиды.

Механизм анионного обмена можно представить в виде уравнения:

X - + R+Y - ↔ Y - + R+X -

Аналогично уравнение для катионного обмена:

Х+ + R -Y+ ↔ Y+ + R -X+

В первом случае ион образца X - конкурирует с ионом подвижной фазы Y - за ионные центры R+ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y+ за ионные центры R - вступают катионы образца Х+.

Естественно, что ионы анализируемой пробы, слабо взаимодействующие с ионообменником, при этой конкуренции будут слабо удерживаться в колонке и первыми вымываться из нее и, наоборот, наиболее сильно удерживаемые ионы будут элюированы из колонки последними. Кроме ионных-ионных взаимодействий на поверхности сорбента возникают вторичные взаимодействия неионной природы за счет адсорбции или водородных связей сорбата с неионной частью матрицы или за счет ограниченной растворимости образца в подвижной фазе. Трудно добиться условий, при которых удерживание осуществляется только по ионообменному механизму. Поэтому при прогнозировании удерживания необходимо исходить не только из теоретических закономерностей ионообменной хроматографии, но и из эмпирических наблюдений. Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.

Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы представляют собой в основном сополимеры стирола и дивинилбензола. Относительное содержание дивинилбензола, определяющее степень сшивки скелета ионита выражают в массовых процентах дивинилбензола в мономерной смеси. Обычно добавляют 8-12% последнего. Чем больше содержание дивинилбензола, тем больше жесткость и прочность полимера, выше емкость и, как правило, селективность и тем меньше набухаемость.

Хроматографические материалы, содержащие сульфатные или триалкиламмонийные группы, являются сильными катионнообменниками и сильными анионообменниками и называются соответственно SCX и SAX. Слабые катионообменники и анионообменники получают на основе ионов карбоксилата -СОО - или аммония -NH3+ соответственно. Существуют также жидкие органические ионообменники - несмешивающиеся с водой жидкости, физически нанесенные на пористые или поверхностно-пористые материалы. Жидкие анионообменники - высокомолекулярные амины или их соли, а катионообменники - эфиры фосфорной или фосфиновых кислот.

Для улучшения условий разделения в ионообменной хроматографии иногда получают лигандные комплексы ионов, изменяя при этом их полярность

Fe3+ + 4Сl - ↔ FeCl4-

и делят на анионообменном носителе анионы тетрахлоржелеза. Так как селективность смолы зависит от характера противоиона, часто необходимо изменить форму смолы. Противоионы связаны кулоновскими силами взаимного притяжения с ионообменными группами и экранируют их заряд. Это притяжение зависит от физической природы противоиона, размеров, формы, плотности электронных оболочек. Одни противоионы при равенстве концентраций могут замещать в ионообменнике другие. Ниже приведены ряды противоионов в порядке убывающей активности и уменьшения сродства к ионообменной смоле.

 

HSO4- > ClO3- > NO3- > Br - > CN - > НСО3- > СН3СОО - > OH - > F -

 

Ва2+ > Pb2+ > Са2+> Ni2+ > Cd2+ > Со2+ > Zn2+ > Mg2+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH42+ > Na+ > H+ > Li+

 

M4+ > M3+ > M2+ > M1+

Ионообменники характеризуются степенью набухания и емкостью. Степенью набухания называют объем упакованного в колонну обменника (в мл), приходящийся на 1 г его в сухом виде, и имеет размерность мл/г. Максимальное количество ионов, которое может связать ионообменник, определяет его обменная емкость, которая совпадает с концентрацией ионогенных групп.

АФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

 

 

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации.

ТИПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В АХ

Фермент <=> Субстрат; Антитело <=> Антиген, вирус, клетка; Агглютинин (лектин) <=> Агглютиноген (полисахарид, гликопротеин, рецептор клетки); Нуклеиновая кислота <=> Последовательность комплементарных оснований, гистоны, НК-полимеразы, НК-связывающие белки; Гормон, витамин <=> Рецептор, белок-носитель; Глутатион <=> Глутатион-S-трансфераза, гибридный белок; Ион металла <=> Полигистидиновый таг гибридного белка (металл-хелатная ах

 

Применение АХ

1. Выделение рекомбинантного продукта непосредственно из культуральной жидкости.

Культуральная жидкость наносится на колонку, упакованную афинным к целевому белку сорбентом. Только целевой белок сорбируется, а примесные (баластные) белки элюируются без сорбции.

2. Высокопроизводительная очистка ферментов.

АХ не приводит к денатрации ферментов или потери активности, поэтому представляет собой замечательный метод для специфической очистки. Сродство сорбента к ферменту основано, как правило, на специфическом связывании активного центра.

3. Очистка гибридных белков.

Гибридный белок - это рекомбинантный предшественник целевого белка, имеющий в составе особую ДНК-кодируемую последовательность аминокислот (называемую лидерным фрагментом), выполняющую роль маркера экспрессии. Т.е. ГБ=целевой белок+лидерный фрагмент. Последовательность ГБ, биосинтезируемая штаммом-продуцентом, определяется на генетическом уровне (великими дяденьками - генными инженерами). Генные инженеры могут конструировать такой лидерный фрагмент, который может облегчить афинную очистку. Такой лидерный фрагмент называется ТАГ.

Основные ТАГи:

- глутатион-S-трансферазный (GST-ГБ). Афинен к сорбенту за счет глутатионного остатка, который вступает с таким же остатком сорбента во взаимодействие, образуя дисульфидное производное.

- полигистидиновый (ПолиГис-ГБ). Способен к координации вокруг никеля (2+), которым иммобилизован сорбент. Образуемый металл-хелатный комплекс дает другое название такому методу АХ - металл-хелатная хроматография.

4. Удаление из гидролизата ферментов класса сериновых протеаз (тромбин, трипсин, зимоген).

Выделение ГБ сопровождается высвобождением протеолитических ферментов продуцента, которые могут гидролизовать ГБ. Сериновые протеазы, имеющие специфичность к оснОвным аминокислотам (аргинину и лизину), вынуждают исследователей применять ингибиторы протеаз, что зачастую неудобно. Альтернатива: использовать АХ. Достоинства АХ: защита ГБ от протеолиза; очистка протеаз.

Основные лиганды АХ, которые используются для этих целей:

- синтетический ингибитор парааминобензамидин;

- аргининовый остаток.

5. Выделение ДНК-связывающих белков.

ДНК-связывающие белки - класс белков, которые благодаря сродству к НК способны:

- к репликации и ориентации молекул ДНК (гистоны, нуклеосомы, репликазы)

- к участию в транскрипции (ДНК-полимеразы, активаторы транскрипции, репрессоры, рестриктазы).

 

Лиганд сорбентов:

- гепарин (гексуроновая кислота+D-глюкозамин)

6. Очистка гликопротеинов, гликолипидов, полисахаридов.

Гликолипиды, гликопротеины и полисахариды способны обратимо связываться с лектинами. Т.е. лектины можно использовать как лиганды для иммобилизации сорбентов.

 

92.Иммунохроматография: применение

 

Иммунохроматографическая экспресс-диагностика (ИХЭД) – новый высокотехнологичный метод, позволяющий вне лабораторных условий и в течение 5-20 минут не только точно диагностировать большой спектр самых серьезных патологий (инфаркт миокарда, опасные инфекции, воспалительные процессы, онкозаболевания, гормональные нарушения и др.), но и оценивать степень их тяжести. Широкое применение ИХЭД позволяет обнаруживать заболевания на ранней стадии и предотвращать их развитие, особенно это касается опухолей простаты и осложнений сахарного диабета. Некоторые из этих тестов настолько просты, что могут проводиться в домашних условиях.

 

 

93. Металл-хелатная хроматография. Афинная хр-я применяется для очистки гибридных белков.

Гибридный белок - это рекомбинантный предшественник целевого белка, имеющий в составе особую ДНК-кодируемую последовательность аминокислот (называемую лидерным фрагментом), выполняющую роль маркера экспрессии. Т.е. ГБ=целевой белок+лидерный фрагмент. Последовательность ГБ, биосинтезируемая штаммом-продуцентом, определяется на генетическом уровне (великими дяденьками - генными инженерами). Генные инженеры могут конструировать такой лидерный фрагмент, который может облегчить афинную очистку. Такой лидерный фрагмент называется ТАГ.

Основные ТАГи:

- глутатион-S-трансферазный (GST-ГБ). Афинен к сорбенту за счет глутатионного остатка, который вступает с таким же остатком сорбента во взаимодействие, образуя дисульфидное производное.

- полигистидиновый (ПолиГис-ГБ). Способен к координации вокруг никеля (2+), которым иммобилизован сорбент. Образуемый металл-хелатный комплекс дает другое название такому методу АХ - металл-хелатная хроматография. МХХ используетс для очищения рекомбинантных или природных белков на никелевых ионных колонках.

Энантиоселективная хроматография.

Разделение (чаще всего ВЭЖХ) энантиомеров смеси, основанное на использовании оптически селективной прививки сорбента.

Метод: элюентный

 

Энантиомеры -

Оптически активные изомеры, вращающие плоскость поляризации света на один и тот же угол, но в противоположные стороны (D-вправо; L-влево)

 

СВОЙСТВА ЭНАНТИОМЕРОВ:

 

В оптически Неактивном окружении свойства абсолютно идентичны:

 

 

- физические (температуры кипения и плавления, растворимость, pI, Mw);

 

- спектральное поглощение (в любой области);

 

ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В АНАЛИЗЕ ПРИРОДНЫХ ВОД

Метод тонкослойной хроматографии определения ХОП в природных водах. [11]

Метод основан на извлечении ХОП из воды гексаном, сернокислотной очистке экстракта и определении в тонком слое сорбента на оксиде алюминия, силикагеле или пластинках силуфол в различных системах подвижных растворителей с проявлением мест локализации пестицидов различными проявляющими реагентами.

Подготовка к определению. Тщательно промытую хромовой смесью, содой, дистиллированной водой и высушенную пластинку протирают этиловым спиртом или эфиром и покрывают сорбционной массой. Массу готовят следующим образом. Смешивают 50 г просеянного через сито с размером отверстий 0,149 мм оксида алюминия в фарфоровой ступке с 5 г сульфата кальция, прибавляют 75 мл дистиллированной воды и перемешивают в ступке или колбе до образования однородной массы. На пластинку 9 * 12 см наносят 10 г сорбционной массы (на пластинку 13 Х 18 см - 20 г) и, покачивая, равномерно распределяют по всей пластинке. Пластинки сушат при комнатной температуре 18-20 ч, можно сушить 20 мин при комнатной температуре, а затем 45 мин в сушильном шкафу при 110 °С.

Смешивают 35 г силикагеля КСК, просеянного через сито с размером отверстий 0,149 мм, с 2 г сульфата кальция и 90 мл дистиллированной воды и перемешивают в ступке или колбе до однородной массы. Наносят на пластинки и сушат, как указано выше. Порция рассчитана на 10 пластинок.

Если пластинки с тонким слоем силикагеля темнеют после УФ-облучения, силикагель перед применением следует очистить от примесей. Для этого силикагель заливают на 18-20 ч разбавленной соляной кислотой (1: 1), кислоту сливают, промывают силикагель водой и кипятят в круглодонной колбе 2-3 ч с разбавленной азотной кислотой (1:1), промывают проточной водопроводной, затем дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4-6 ч при 1300с. Силикагель дробят и просеивают через сито с размером отверстий 0,149 мм.

Пластинки для хроматографии силуфол UV-254 (ЧССР) перед использованием импрегнируют о-толидином. Для этого каждую пластинку опускают на 0,5 см в 0,1 % -ный раствор о- толидина в ацетоне, налитый в камеру для хроматографирования. Пост того как фронт растворителя поднимется до верхнeгo края пластинки, ее вынимают и сушат на воздухе, избегая прямого солнечного света. После этого пластинки готовы к работе. Пластинки, импрегнированные о-толидином, хранят в эксикаторе.

Пластинки силуфол UV-254 предварительно промывают дистиллированной водой в хроматографической камере, высушиваю на воздухе и непосредственно перед использованием активирую в сушильном шкафу 4 мин при 65 ОС.

Ход определения. Экстракцию ХОП и концентрирование экстракта проводят по схеме, изложенной выше, при определении ХОП методом ГЖХ. При необходимости экстракты обрабатывают концентрированной серной кислотой, как указано в том же разделе.

Сконцентрированный до 1-2 мл экстракт (без очистки или после сернокислотной очистки) количественно с помощью ацетона переносят в коническую пробирку вместимостью 5 мл. В пробирку помещают заплавленный в верхней части стеклянный капилляр и удаляют растворитель на горячей водяной бане до объема 0,2-0,3 мл. Остаток количественно, с помощью того же стеклянного капилляра, но с отломанным запаянным концом, наносят на хроматографическую пластинку в одну точку, так чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Остаток экстракта в колбе смывают тремя порциями по 0,2 Мл диэтилового эфира, которые наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2 см наносят стандартные растворы, содержащие 1; 3; 5,..., 10 мкг исследуемых препаратов (или другие количества препаратов, близкие к определяемым концентрациям препаратов).

Пластинки с нанесенными растворами помещают в хроматографическую камеру, на дно которой за 30 мин до начала хроматографирования наливают подвижный растворитель. При использовании пластинок с тонким слоем оксида алюминия или силикагеля в качестве подвижного растворителя применяют н-гексан или смесь гексана с ацетоном в соотношении 6: 1 для препаратов, R, которых в гексане ниже 0,3. При использовании пластинок силуфол подвижным растворителем является' 1 % -ный раствор ацетона в гексане, а при использовании пластинок силуфол, импрегнированных о- толидином,- гексан с диэтиловым эфиром в соотношении 49: 1. Край пластинки с нанесенными растворами может быть по гружен в подвижный растворитель не более чем на 0,5 см.

После того как фронт растворителя поднимется на 1О см, пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут для испарения растворителя. Далее пластинку орошают одним из проявляющих реактивов и подвергают действию УФ-лучей 10 - 15 мин (лампа ПРК-4). Пластинки следует располагать на расстоянии 20 см от источника света.

При обработке хроматограмм проявляющими реактивами на основе нитрата серебра ХОП проявляются на хроматограммах в виде серо-черных пятен на белом фоне. Окраска пятен устойчива несколько дней.

После обработки пластинок ортотолидиновым реактивом и УФ – облучением гексахлоран и эфиросульфонат проявляются через 20-35 минут в виде зелено-оранжевых пятен, устойчивых 2-3дня.

Определение полиароматических углеводородов в объектах окружающей среды методами жидкостной и тонкослойной хроматографии. [7]

Было определено содержание полиароматических углеводородов (ПАУ), в частности, бенз(а)пирена в снежном покрове. Пробоподготовку осуществляли экстракцией диэтиловым эфиром. Качественный анализ осуществляли методом тонкослойной хроматографии. Пробы наносили на пластину Silufol UV-254 и осуществляли хроматографический анализ в двух системах: система 1 - раствор кофеина в хлороформе; система 2 - смесь циклогексана и н-гексана. Использование системы 1 позволило снизить нижний предел обнаружения.

Количественный анализ осуществляли методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Исследование проводили на хроматографе «Цвет-500» с пламенно-ионизационным детектором. В качестве сорбента использовали силиконовый каучук SE-54 с нанесенной на него неподвижной фазой OV-101. Анализ проводили в режиме программирования температуры от 200 до 310° С со скоростью 4 С /мин. В качестве газа-носителя использовали азот. Метод позволил определить ПАУ на уровне ПДК.

- химические (ионизация, ОВ-потенциал)

В оптически активном окружении свойства абсолютно отличны:

- разный угол отклонения линейного поляризованного света (+ или -);

- разные взаимодействия с хиральными реагентами (диастереометрическое образование);

- разные взаимодействия с биомолекулами, биорецепторами

Разделение энантиомеров?

(три способа разделения энантиомеров хроматографией)

Неподвижная фаза НЕхиральна; подвижная фаза включает хиральные добавки (циклодекстрин; (+)-ди-n-бутил-тартрат).

 

Неподвижная фаза НЕхиральна, подвижная фаза также НЕхиральна (реакция аналита с оптически активным реагентом >>> изменение свойств одного из изомеров >>> различное хроматографическое поведение).

Неподвижная фаза хиральна, подвижная фаза НЕхиральна (использование специальных хиральных сорбентов для ВЭЖХ-анализа или разделения энантиомеров).

Поскольку разные энантиомеры биологически активных веществ обладают разным действием на организм, хиральная хроматография наиболее часто применяется для анализа фармацевтических препаратов и полупродуктов их синтеза. Другой областью ее применения является органическ

ая химия хиральных соединений.

95. Плоскостная хроматография – метод разделения, анализа и физико-химического исследования веществ, в котором перемещение подвижной фазы происходит благодаря капиллярным силам. Плоскостная Х. подразделяется на тонкослойную, в которой тонкий слой гранулированного сорбента или пористая плёнка наносится на стеклянную или металлическую пластинки, и бумажную, где для этого используют специальную хроматографическую бумагу.

Дериватизация

Среди существующих методических подходов к определению гистамина и биогенных аминов можно назвать:

- полимерный, разработанный специалистами из университета Южной Каролины и основанный на использовании полимера, меняющего цвет в присутствии биогенных аминов [7];

- радиоизотопный, флюорометрический, иммуноферментный, колоримет-рический, газовой и масс-спектрометрии.

В настоящее время наиболее широко используемым методом является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, что соответствует требо-ваниям регламента комиссии ЕС 2073/2005. Метод основан на экстракции биогенных аминов вместе с аминокислотами, растворами органических кислот из субстрата, с последующим применением полученного экстракта для хрома-тографического определения. Поскольку детектирование биогенных аминов как таковых затруднено, в данном методе используется пред- или постколоночная дериватизация – получение производных анализируемого вещества, обладающих иными аналитическими свойствами (например, иным УФ-спектром, флуоресцен-цией, термической стабильностью, летучестью и пр.).

В частности, в лаборатории Испытательного Центра ФГУП АтлантНИРО иcпользуется методика определения массовых долей гистамина, кадаверина, путресцина, тирамина, спермина и спермидина с применением высокоэффек-тивной жидкостной хроматографии.

Нами были проведены работы по выбору наиболее оптимальных условий выделения биогенных аминов из рыбного сырья и рыбопродукции и условий их разделения. Были установлены параметры сходимости и воспроизводимости и разработан проект ГОСТ Р 53149-2008 «Продукты пищевые. Рыба, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Количественное определение содержания биогенных аминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» [8].

Сущность метода заключается в экстракции разбавленным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) биогенных аминов из гомогенизированной пробы, очистке экстракта на ионообменной смоле Amberlite-CG50, предколоночной дериватизации аминов для получения интенсивно флуресцирующих производных (получение производных аминов с 5-диметиламино-нафталинсульфонил хлоридом (дансил-хлоридом или ДНС-хлоридом)) с последующим количественным определением выделенных аминов высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Предел обнаружения массовых долей аминов в анализируемых продуктах 0,1 мг/кг.

В зависимости от задачи, аминокислотные анализаторы поддерживают как классический метод анализа аминокислот на основе постколоночной дериватизации реакцией с нингидрином, так и высокочувствительные методы предколоночной дериватизации с ортофталевым альдегидом (OPA) и 9-флуоренилметилхлороформиатом (FMOC). Для каждого варианта аминокислотного анализа помимо оборудования предлагается аналитический комплект, включающий колонку, предколонку и набор необходимых реактивов.

1. Классический анализ методом постколоночной дериватизации заключается в разделении аминокислот на ионообменной колонке при ступенчатом градиенте pH и последующей реакции с нингидрином в реакторе системы Pinnacle PCX. Обнаружение окрашенных производных аминокислот проводится при помощи спектрофотометрического детектора на длинах волн 570 и 440 нм. Этот метод получил широкое распространение для анализа пищевых продуктов и кормов, а также в клинических и генетических исследованиях.

2. Анализ аминокислот методом предколоночной дериватизации с флуоресцентными маркерами (OPA, FMOC и др.) обладает более высокой чувствительности по сравнению с классическим методом. Аминокислоты обрабатываются орто-фталевым альдегидом, ОРА (в реакторе системы Pinnacle PCX или автосамплере), разделяются на обращенно-фазной колонке в режиме бинарного градиента. Для регистрации аминокислот используется флуоресцентный детектор, количественный анализ проводится при длине волны на канале возбуждения 330 нм и на канале регистрации 450 нм. Гидролизаты белков анализируются так же хорошо, как и физиологические жидкости. Метод позволяет обнаруживать следовые количества аминокислот и, потому, нашел широкое применение в медицине.

Метод с преколоночной дериватизацией основывается на обращенно-фазной хроматографии. Сначала получают производные аминокислот. Производные малополярны и благодаря поглощению в УФ-обпасти спектра их можно детектировать фотометрически. Используются обращенно-фазные колонки и градиентное элюирование с возрастающей концентрацией ацетонитрила.

 

98. Физико-химический метод разделения жидких или газообразных смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна; Хроматография широко применяется для анализа биологических макромолекул, имеется ряд методов - тонкослойная Хроматография, Хроматография на бумаге, ионобменная Хроматография, адсорбционная Хроматография и др.

99.

ЭФ фракций крови и ЛП.

Плазменные липопротеины имеют сферическую форму. Внутри находится жировая «капля», содержащая неполярные липиды (триглицериды и эстерифицированный холестерин) и формирующая ядро ЛП-частицы. Оно окружено оболочкой из фосфолипидов, неэстерифицированного холестерина и белка.

 

Существует несколько методов определения липопротеинов в крови. Один из них - определение содержания холестерина в различных классах липопротеинов - рассмотрен выше. Другой метод исследования содержания липопротеинов - электрофоретический. При использовании этого метода отдельные фракции липопротеинов классифицируют, сравнивая их электрофоретическую подвижность с подвижностью обычных сывороточных белков. На основании электрофоретической подвижности липопротеинов были разделены на следующие фракции.

Хиломикроны. При проведении электрофореза хиломикроны остаются на старте (содержат очень мало белка) подобно у-глобулинам; представляют собой богатые жиром частицы, поступающие в кровь из лимфы и транспортирующие пищевые триглицериды. Они являются самыми крупными липопротеинами. Плазма крови здоровых людей, не принимавших пищи в течение 12-14 ч, хиломикроны не содержит или содержит их в ничтожном количестве.

Альфа-липопротеины. При электрофорезе а-ЛП движутся вместе с альфа-глобулинами и соответствуют ЛПВП. ЛПВП содержат до 50% белка, приблизительно 30% фосфолипидов, 20% ХС и очень немного триглицеридов. Образуются в печени и стенке тонкой кишки.

Бета-липопротеины. При электрофорезе на бумаге бета-ЛП движутся вместе с бета-глобулинами и соответствуют ЛПНП. ЛПНП содержат 25% белка, 50% ХС, 20% фосфолипидов и 8-10% триглицеридов. Предполагают, что ЛПНП образуются частично или полностью при распаде липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП).

Пре-бета-липопротеины. При электрофорезе пре-бета-липопротеины оказываются между альфа-липопротеинами и бета-липопротеинами, они соответствуют ЛПОНП.

Электрофорез плазмы крови

При изучении белкового спектра крови в качестве унифицированного метода используется зональный электрофорез с поддерживающей средой-носителем.

Под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, имеющие отрицательный заряд, движутся по смоченной буферным раствором бумаге по направлению к положительному электроду со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярной массы частиц.

Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются на пять фракций: альбумины, α1-, α2-, β-, γ-глобулины.

Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и небольшой молекулярной массой, поэтому они продвигаются в электрическом поле с наибольшей скоростью и дальше других фракций отстают от линии старта. С меньшей скоростью движутся α1-, α2- и β-глобулины.

Наименьшей скоростью продвижения отличаются γ-глобулины, они практически остаются на линии старта.

γ-глобулины — крупные белковые молекулы, их заряд близок к нейтральному.

Окрашенные пятна белковых фракций, полученные методом электрофореза на бумаге или других носителях, носят название электрофореграммы.

Измерения и расчет содержания белковых фракций проводят при денситометрическом сканировании электрофореграмм. Получаемые денситограммы представляют собой графики зависимости оптической плотности и подвижности каждой фракции. Площадь пика пропорциональна количеству белков, находящихся в соответствующей фракции.

Иммуноэлектрофорез.

Выявления и идентификация нозологических форм иммунодефицитных состояний - актуальнейшая проблема клинической медицины. Одним их наиболее информативных методов первичной диагностики иммунодефицитов является электрофоретическая протеинограмма сыворотки крови.

В последние годы все большую диагностическую значимость приобретает электрофорез высокого разрешения протеинов, который позволяет выделить около 15 фракций белков. Число фракций зависит от среды, на которой происходит разгонка, и техники окрашивания. Наряду с числом компонентов, их качественной и количественной характеристикой иногда возникает необходимость дальнейшего более подробного исследования. В 1976 году для изучения иммуноглобулинов был предложен метод иммунофиксации. Электрофорез с иммунофиксацией (JFE) - это двухступенчатый процесс, использующий электрофорез протеинов на первом этапе и иммунопреципитацию на втором. При этом исследованию может быть подвергнута сыворотка крови, моча, спинномозговая или другая жидкость организма. На электрофоретически разделенные антигены наносят иммунные сыворотки, содержащие различные специфические антитела. При встрече соответствующих антигена и антитела в зоне оптимального их соотношения наблюдается реакция преципитации невооруженным глазом. Иммунный электрофорез объединяет преимущества электрофореза и иммунной реакции: высокая разрешающая способность метода, разделяющая компоненты анализируемой системы на основе электрофоретической мобильности и высокая специфичность иммунных антисывороток. Электрофорез с иммунофиксацией - один из современнейших методов в кинической лаборатории для получения характеристик моноклональных иммуноглобулинов.

Иммуноблоттинг.

Иммуноблоттинг (иногда называемый вестерн-блоттингом от английского Western - западный) - это метод исследования белковых антигенов. Белки разделяют с помощью электрофореза и переносят на мембрану. Затем мембрану инкубируют в растворе антител и связанные антитела выявляют с помощью радиоизотопного или ферментного методов.

Если белки антисыворотки разделить изоэлектрофокусированием, а затем перенести (это и называется блотингом) на мембрану, то с помощью меченого антигена можно установить и так называемый спектротип антисыворотки, т.е. определить изотип антител, взаимодействующих с данным антигеном.

ИММУНОБЛОТТИНГ

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией. Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, - дот-блот анализ - либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза - Вестерн-блот анализ (Western blotting). Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов. Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера). В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлоза может связывать до 80 - 100 мкг белка на 1 см2. Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок ет возможность предварительно исследовать полиморфизм определенных генетических локусов по длинам соответствующих рестрикционных фрагментов ДНК.