Изоферменты ЛДГ и их диагностическое значение

Активность изоферментов ЛДГ в сыворотке крови в порядке убывания: ЛДГ₂ > ЛДГ₁ > ЛДГ₃ > ЛДГ₄ > ЛДГ₅.

Изоферменты ЛДГ в лейкоцитах в норме: ЛДГ₃ > ЛДГ₂, > ЛДГ₄ > ЛДГ₁ > ЛДГ₅.

Инфаркт миокарда: ↑↑↑ ЛДГ₁, ↑ ЛДГ₂. ЛДГ₁/ЛДГ₂ > 1. Изменения в активности изоферментов сохраняются дольше, чем суммарной активности фермента. При неясной клинической картине и нормальной общей активности ЛДГ повышение активности ЛДГ₁ указывает на мелкие некротические очаги в миокарде, не регистрируемые другими способами.

Паренхиматозная желтуха: ↑↑↑ ЛДГ₅ и ЛДГ₄, ↓ЛДГ₁ и ЛДГ₂.

Мышечные дистрофии: в мышечной ткани ↓↓ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (степень снижения коррелирует с тяжестью заболевания), ↑↑ ЛДГ₁, ЛДГ₂, и ЛДГ₃. В сыворотке крови ↑↑ ЛДГ₁, ЛДГ₂ и ЛДГ₃.

Диагностическое значение изоферментов ЛДГ

Острый лейкоз: ↑↑↑ ЛДГ₂, ↑ЛДГ₃. Прямо пропорциональная зависимость между увеличением ЛДГ₂ и количеством незрелых клеток.

Опухолевые заболевания: ↑↑ ЛДГ₃ ЛДГ₄ и ЛДГ₅ в опухолевой (приближение к эмбриональному типу). Различия между злокачественными и доброкачественными максимальны по ЛДГ₅. Степень изменения спектра изоферментов коррелирует с ростом опухоли.

Заболевания легких: ↑↑ ЛДГ₃ при пневмониях. При выраженной гипоксии ↑ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (активация гликолиза в связи с перестройкой метаболизма на анаэробный тип).

50. Креатинкиназа (КК), методы определения, клинико-диагностическое значение.

КК катализирует обратимую реакцию образования креатинфосфата из креатина и АТФ. Креатинфосфат является макроэргическим фосфатом, используемым мышцами для сокращения, расслабления и транспортировки метаболитов. Молекулы КК имеют свои особенности распределения в организме. Существуют три активных изофермента КК: мышечный изоэнзим-КК-ММ, сердечный изоэнзим-КК-МВ, мозговой изоэнзим-КК-ВВ.

Метод определения: При определении активности креатинкиназы-MB используется модифицированный метод Вурцберга и др.

Активность фермента измеряется в присутствии антител к мономеру креатинкиназы-M, которые полностью ингибируют креатинкиназу-MM, но не влияют на активность В-субъединиц креатинкиназы-MB и креатинкиназы-BB.

Установлено, что в сыворотке крови здоровых людей активность ММ-изофермента составляет около 95% общей активности КК, и около 5% приходится на активность КК-МВ. При остром инфаркте миокарда спустя 4—6 ч после развития очага повышается активность КК. Максимум активности КК выявляется в течение 12—36 ч, увеличение активности происходит в основном в результате подъема активности КК-МВ.

Клинико-диагностическое значение

Активность общей креатинкиназы повышается при многих заболеваниях: инфаркте миокарда, сахарном диабете, гипотиреозе, мышечных травмах, а также после внутримышечных инъекций, больших физических нагрузок, при дигитализации, хирургических вмешательствах, при мышечных дистрофиях всех типов, инфекционных болезнях, дефибрилляции, застойной сердечной недостаточности, тахикардии, эмболии легочной артерии, генерализованных судорогах, обширном инфаркте мозга, беременности, опухолях предстательной железы, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта, отеке легкого, остром психозе, травмах головы, инфарктах желудочно-кишечного тракта. Среди пациентов кардиологического отделения подъем активности КК имеет чувствительность 97%, специфичность 67% для инфаркта миокарда.

51. Амилаза и липаза, методы определения, клинико-диагностическое значение. Макроамилаземия. Амилазо-креатининовый индекс.

Амилаза сыворотки и мочи

Гидролазы, катализирующие гидролиз полисахаридов. В плазме амилаза двух изоэнзимных типов - панкреатическая – Р-тип (составляет 40%) и слюнная – S-тип (60%). С мочой выделяется в основном Р-тип.

Норма в сыворотке 16-30 г/чхл, в моче – до 160 г/чхл.

Методы определения могут быть разделены на 3 основные группы: амилокластические, классические «сахарогенные», включая методы с использованием сопряженных ферментативных реакций, и хромогенные, основанные на применении синтетических комплексов крахмал–краситель или 4-нитрофенил-гликозидов.

1. Методы, основанные на использовании крахмала

1.1. Амилокластические методы.

Трудности при использовании крахмала в качестве субстрата связаны с тем, что образцы крахмала значительно отличаются по многим параметрам, в частности по соотношению амилозы и амилопектина. Длина цепи молекулы крахмала зависит от способа его получения и метода приготовления раствора субстрата. Крахмал нерастворим в воде. При приготовлении субстрата он образует коллоидный раствор, содержащий гидратированные мицеллы различного размера. Степень дисперсности меняется в зависимости от температуры; при более низких температурах образуются более крупные мицеллы. Наиболее часто используют картофельный и кукурузный крахмал. В этих методах активность амилазы определяют по уменьшению концентрации субстрата реакции — крахмала. Йодометрические методы оказались наиболее популярными. В ставшем классическим йодометрическом методе Вольгемута ряд последовательных разведений исследуемого образца инкубируют с крахмалом и определяют то разведение исходного материала, которое обеспечивает полный гидролиз крахмала в течение определенного промежутка времени. В других популярных вариантах амилокластического метода скорость реакции оценивали по количеству крахмала, расщепленного в ходе инкубации. Избыток крахмала определяли по изменению поглощения комплекса йод–крахмал.

1. 2. Турбидиметрические и нефелометрические методы

Турбидиметрические методы основаны на способности амилазы снижать мутность суспензии субстрата в результате ферментативной деградации молекулы субстрата [18]. Использование лазерной нефелометрии привело к повышению аналитической чувствительности и точности по сравнению с обычными нефелометрами [19]. Турбидиметрические и светорассеивающие методы выполняют путем непрерывной регистрации или фиксированного времени. Эти методы сложно стандартизировать из-за различий в свойствах субстрата.

Вискозиметрические методы. Основаны на изменении вязкости инкубационной среды в ходе гидролиза крахмала амилазой. В настоящее время не используются.

1.3. Редуктометрические методы

Образец и субстрат инкубируют в течение 30 мин; и в контроле, и в образце определяют редуцирующие соединения. Поскольку конечные продукты реакции амилазы являются редуцирующими соединениями, активность фермента пропорциональна количеству редуцирующих соединений. Для их определения использовали известные в то время методические приемы: восстановление пикрата (Lewis и Bentdict), феррицианида (Haggedorn–Jensen), а также методы, основанные на взаимодействии антрона с углеводами. Количество образовавшихся в ходе реакции редуцирующих сахаров определяли после осаждения белков осадителями, способными дополнительно удалять из раствора ряд компонентов, обладающих редуцирующими свойствами.

Результаты выражали в мг редуцирующих веществ и относили редуцирующую способность к содержанию глюкозы. За единицу активности Somogyi принимали активность амилазы, способную в ходе 30-минутной инкубации при 40 °С и рН 7,0 высвобождать количество редуцирующих веществ, эквивалентное 1 мг глюкозы.

2. Методы, основанные на использовании хромогенных субстратов

В них используют в качестве субстрата олиго- и полисахариды, меченые различными хромогенными группами, высвобождающимися под действием амилазы. Амилаза сыворотки крови гидролизует α-1,4-связи и отщепляет небольшие фрагменты исходной молекулы, связанные с индикаторными группами. Их количество определяют с помощью фотометрических методов после отделения непрореагировавшего субстрата центрифугированием или фильтрацией. Эти методы были популярны в свое время, т. к. они более удобны по сравнению с трудоемкими сахарогенными и амилокластическими методами. Примерами могут служить Amylochrome (Roche Diagnostic System) и Phadebas (Pharmacia Diagnostic).

В технологии «сухой» химии в качестве субстрата компания Kodac ECTACHEM использовала амилопектин, ковалентно связанный с красителем Dimarene Red Z2B.

2.1. Методы, использующие субстраты с определенной структурой

Использование субстратов амилазы с определенной структурой, а также вспомогательных и индикаторных ферментов улучшило стехиометрию реакции и привело к контролируемым условиям гидролиза субстрата при определении активности амилазы.

Оказалось, что гидролиз амилазой небольших по размерам олигосахаридов приводит к появлению продуктов реакции с более определенной структурой по сравнению с продуктами гидролиза крахмала. Из многих олигосахаридов наиболее удобными субстратами для определения активности α-амилазы оказались мальтопентоза и мальтотетроза, в связи с их высокой стабильностью, постоянными продуктами гидролиза и однозначной стехиометрией реакции.

2.2. Методы, использующие в качестве субстратов 4-нитрофенил-гликозиды

Субстраты синтезируют путем присоединения 4-НФ к редуцирующему концу определенного олигогликозида. Если олигосахарид — мальтогептоза (Г7), то субстрат — 4-НФ-Г7. Амилаза расщепляет данный субстрат с образованием свободных олигосахаридов (Г5, Г4, Г3) и 4-НФ-Г2 (9%), 4-НФ-Г3 (31%) и 4-НФ-Г4 (60%). Примечательно, что в значительных количествах не образуются Г6, Г1, 4-НФ-Г6 и 4-НФ-Г5. При добавлении a-глюкозидазы происходит гидролиз 4-НФ-Г4 до 4-НФ и олигосахарида; 4-НФ-Г3 и 4-НФ-Г2 гидролизуются до свободного 4-НФ и глюкозы.

Панкреатический изофермент гидролизует субстрат с большей скоростью, чем слюнный изофермент, в соотношении 1,8: 1.

Совместное действие амилазы и α-глюкозидазы на субстрат приводит к тому, что более 30% продуктов реакции составляет свободный НФ. Свободный НФ обнаруживают по поглощению при 405 нм. Фермент α-глиюкозидаза не действует на олигосахариды, содержащие больше 4 молекул глюкозы в цепи; Г4 гидролизуется чрезвычайно медленно.

3. Методы «сухой химии»

Данная группа методов основана на отщеплении при участии амилазы окрашенного красителя от субстрата-крахмала. Высвободившийся краситель диффундирует в поверхностный слой, где величина отражения определяется фотометрически. Непрореагировавший субстрат остается в реакционном слое и скрыт от фотометрии.

При использовании технологии «сухой» химии сыворотка или гепаринизированная плазма крови может использоваться в качестве образца [26]. В то же время в одном из исследований было показано, что в образцах гепаринизированной плазмы выявлялись значительно более высокие результаты, чем в образце сыворотки крови [27]. Связан ли этот эффект с уникальными свойствами технологии «сухой» химии и насколько гепарин влияет на результаты определения активности амилазы в системах «dry chemistry» — неизвестно.

Исследуемый материал

За исключением гепарина, все антикоагулянты ингибируют активность амилазы, поскольку способны связывать ионы Ca2+. Соли лимонной кислоты, ЭДТУК и оксалат ингибируют активность на 15%. В связи с этим для определения АМИ следует использовать сыворотку или гепаринизированную плазму крови. Фермент весьма устойчив, его активность не меняется при хранении в течение 4 дней при комнатной температуре, 2 недель — при +4 °C, 1 года — при –25 °C и 5 лет — при –75 °C [28].