Цель работы ‑ определение скорости потребления кислорода суспендированными микроорганизмами (микробиоценозом).
Кислород ‑ один из главнейших движущих факторов эволюционного развития экосистем на Земле. Он широко распространенный в природе, находясь как в связанному (молекулы воды, органические и неорганические соединения), так и свободном состоянии (молекулярный кислород в атмосфере). Он является обязательным химическим элементом любой клетки.
Кислород играет важнейшую роль в обеспечении экологической безопасности естественных водоемов в процессах так называемого "самоочищения", так как предопределяет глубину микробиологической минерализации загрязняющих органических соединений и нитрификации азотосодержащих соединений. Уровень кислорода служит индикатором качества водной экосистемы и отражает состояние естественных механизмов взаимодействия.
Технология биологической очистки сточных вод осуществляется путем аэрации стоков с активным илом в аэротенках и представляет собой комплекс физических, химических и биологических реакций.
Наиболее распространенные аэробные методы биологического очистки основаны на использовании аэробных микроорганизмов, для жизнедеятельности которых необходимо присутствие в воде свободного кислорода.
Скорость потребления кислорода биомассой микроорганизмов прямо пропорциональна скорости удаления питательного субстрата из среды. Она количественно отражает физиологическую активность биоценоза и может служить показателем для оценки состояния естественных и техногенных микробиоценозов в том числе и для выявления факторов токсичности, ингибирования или активации. Скорость потребления кислорода единицей активной биомассы (rО2) измеряется в мг поглощенного кислорода г сухой биомассы за∙час.
Оборудование, реактивы, материалы
Оборудование для определения концентрации кислорода ‑ кислородомер, микрокомпрессор, магнитная мешалка, стеклянный стаканчик на 100 см3, секундомер.
Порядок выполнения работы
1. Микробную биомассу суспендируют в 100 см3 питательной среды до концентрации 1-4 г/дм3. 50 см3 микробной суспензии помещают в стеклянный стаканчик.
2. Стаканчик с суспензией микроорганизмов ставят на магнитную мешалку и включают перемешивание на небольших оборотах, не допускающее оседание биомассы, но и не образующее воронку, которая засасывает воздух. Погружают в суспензию датчик кислородомера на глубину 2-3см.
3. В суспензию помещают диспергатор микрокомпрессора и включают подачу воздуха. Насыщают суспензию воздухом до концентрации кислорода около 4 мг/дм3. Отключают микрокомпрессор и с помощью секундомера засекают время, в течение которого концентрация кислорода в суспензии снижается до 2 мг/дм3.
4. Измерения повторяют еще 2 раза.
5. По результатам 3-х измерений вычисляют среднее значение скорости потребления О2 исследуемым микробиоценозом.
Обработка данных
Удельную скорость потребления кислорода микроорганизмами (микробиоценозом) рассчитывают по формуле:
, (9)
где rО2 ‑ удельная скорость потребления кислорода, мг/г∙ч
О2исх – исходная концентрация кислорода, мг/дм3;
О2кон – концентрация кислорода в конце опыта, мг/дм3;
V ‑ объем исследуемой микробной суспензии, дм3;
t ‑ время в течение которого происходит потребление кислорода, ч;
СВб ‑ концентрация биомассы в исследуемой суспензии, г/дм3.
Схема записи результатов
| № пробы | Исх. концентрация О2, мг/дм3 | Концентрация О2 в конце опыта, мг/дм3 | Время, в течение которого происходит потребление кислорода, ч | Удельная скорость потребления кислорода, мг/г∙ч |
| Ср. значение |
Вопросы для самоподготовки:
1. В каких основных соединениях кислород находится в связанном и свободном состоянии в биосфере?
2. Какую роль играет кислород в процессах так называемые самоочищения?
3. Как используется кислород в технологии биологической очистки сточных вод в аэротенках?
4. Какому параметру обмена веществ аэробных микроорганизмов прямо пропорциональна скорость потребления кислорода?
5. В каких единицах измеряется скорость потребления кислорода?
Лабораторная работа 9
Влияние тяжелых металлов на рост микроорганизмов
(дрожжей Sactharomyces cerevisiae)
Цель работы ‑ определить 
влияние солей тяжелых металлов на параметры роста культуры микроорганизмов (урожай биомассы, экономический коэффициент), физиологическую активность (скорость потребления кислорода) и вычислить константу ингибирования.
Тяжелые металлы являются сильными антимикробными веществами. Проникая во внутрь клетки, они взаимодействуют с белками цитоплазмы, образуя с ними не растворимые в воде соединения и вызывают тем самым их коагуляцию. Тяжелые металлы инактивируют ферменты, связываясь в группами активного центра. Так, соли ртути, серебра, мышьяка реагируют с сульфгидрильными группами, изменяя их структуру и нарушая их активность. Эти ингибиторы не отличаются специфичностью, а действуют на все ферменты содержащие сульфгидрильные группы.
Установлено, что антимикробное действие тяжелых металлов зависит от концентрации ионов металлов и от времени воздействия их на микробы. Гибель микроорганизмов при действии тяжелых металлов наступает в результате адсорбции положительно заряженных катионов, отрицательно заряженными клетками бактерий. Кроме того, ионов металлов, в особенности серебра, адсорбированные на поверхности бактериальной клетки, являются энергичными катализаторами в процессе окисления протоплазмы кислорода.
В математических моделях природных биологических процессов, происходящих в условиях техногенной нагрузки, и в математических моделях природоохранных биотехнологий для количественного описания действия ингибиторов используют константу ингибирования Константа ингибирования – концентрация ингибитора (например, тяжелого металла), при которой наблюдается 50% снижение физиологической активности биоты.
Оборудование, реактивы, материалы:
3 конические колбы на 100 см3; стеклянные воронки, бумажные фильтры, оборудование и реактивы для определения ХПК, оборудование для определение концентрации биомассы – нефелометрическим методами или методами прямого счета в камере Горяева (лабораторная работа № 2), лабораторный шуттель-аппарат, питательная среда, кислородомер, микрокомпрессор, магнитная мешалка, стеклянный стаканчик на 100 см3, секундомер.
Порядок выполнения работы:
1. Готовят раствор CuSО4. 100 мг CuSО4∙5Н2О растворяют в 100 см3 дистиллированной воды. Концентрация Cu2+ в этом растворе составляет 0,26 мг/ см3;
2. Готовят 200 см3 питательной среды: глюкоза ‑ 10, (NH4)2SO4 – 0,5, KH2PO4 – 0,5 г/дм3. Отбирают 40 см3 для анализа ХПК;
3. В оставшуюся питательную среду вводят культуру дрожжей Sactharomyces cerevisiae. В 3 конические колбочки отливают по 50 см3 суспензии микроорганизмов в питательной среде. Колбочки помечают и в опытные варианты вводят раствор CuSО4: № 1 – контрольная (без добавления раствора CuSО4), в № 2 добавляют 0,2 см3 раствора CuSО4 (который создает в микробной суспензию концентрацию Cu2+ 1 мг/дм3), в № 3 добавляют 1,0 см3 раствора CuSО4 (который создает в микробной суспензию концентрацию Cu2+ 5 мг/дм3). Колбы с суспензией биомассы в питательной среде устанавливают в шуттель-аппарате и включают встряхивание на 1-2 ч.
4. В оставшейся суспензии микроорганизмов определяют концентрацию биомассы нефелометрически и методом прямого счета в камере Горяева (лабораторная работа № 2).
5. Определяют ХПК исходной питательной среды. 1 мг/дм3 глюкозы имеет ХПК =1 мг/дм3.
6. Останавливают встряхивание и проводят исследование характеристик микробных суспензии в контрольной и опытных колбах. В суспензиях определяют концентрацию биомассы (лабораторная работа № 2). При микроскопировании препаратов обращают внимание на размеры и состояние клеток дрожжей.
7. В контрольном и опытных вариантах микробных суспензий определяют скорость потребления кислорода (лабораторная работа № 6).
8. Суспензии фильтруют. Биомассу на фильтре отбрасывают, а в фильтрате определяют ХПК. 1 мг/дм3 глюкозы имеет ХПК =1 мг/дм3.
9. Рассчитывают параметры роста культуры микроорганизмов (урожай биомассы, экономический коэффициент), скорость потребления кислорода в опытном и контрольном вариантах
10. Строят зависимость эффекта ингибирования от концентрации тяжелого металла в и устанавливают константу ингибирования
Обработка данных
Эффект снижения физиологической активности биоты (урожая биомассы, экономического коэффициента, скорости потребления кислорода) при воздействии ингибитора по сравнению с развитием без ингибиторного воздействия рассчитывают по результатам экспериментальных исследований:
, (10)
где Эи – эффект ингибирования, %;
А0 ‑ физиологическая активность биоты без воздействия ингибитора;
Аи ‑ физиологическая активность биоты при воздействии ингибитора.
На основании определений эффектов снижения физиологической активности строят графическую зависимость эффекта ингибирования от концентрации ингибитора и устанавливают константу ингибирования (рис. 7).
Рисунок 7 ‑ Влияние концентрации ингибитора на эффект ингибирования
Константу ингибирования можно рассчитать и по формуле:
, (11)
где Си – концентрация ингибитора, при которой установили эффект ингибирования.
Схема записи результатов
| Концентрация Cu2+, мг/дм3 | Влияние на потребление О2 | Влияние на синтез биомассы | Влияние на стехиометрическую константу роста | ||||||
| Скорость потребления О2, мг/г∙ч | эффект ингибирования,% | Константа ингибирования | Урожай биомассы, г | эффект ингибирования,% | константа ингибирования | экономический коэффициент, г/кг | эффект ингибирования,% | константа ингибирования | |
| 1,0 | |||||||||
| 5,0 |
Вопросы для самоподготовки:
1. Почему тяжелые металлы являются сильными антимикробными веществами?
2. Что такое константа ингибирования?
3. Какие параметры роста культуры микроорганизмов можно использовать для количественного определения константы ингибирования?
4. Какие показатели физиологической активности культуры микроорганизмов можно использовать для количественного определения константы ингибирования?
5. Являются ли тяжелые металлы специфическими ингибиторами?
БИОИНДИКАЦИЯ ПОЧВЫ
Лабораторная работа №10
