I Прямая коррекция мутационных повреждений

Репликация ДНК

Репликация – это процесс самовоспроизведения макромолекул нуклеиновых кислот, обеспечивающий точное копирование генетической информации и передачу её от поколения поколению. В основе механизма репликации лежит ферментативный синтез одной цепи ДНК на другой цепи-матрице ДНК. Свойство репликации обусловлено оригинальной химической структурой ДНК, состоящей из двух комплементарных цепей. В процессе репликации на каждой из двух полинуклеотидных цепях материнской молекулы ДНК синтезируются комплементарные им цепи. В итоге из одной двойной спирали ДНК образуются две идентичные двойные спирали. Такой способ удвоения молекул, при котором каждая дочерняя молекула содержит одну материнскую и одну вновь синтезированную цепь, назван полуконсервативным.

Гипотеза консервативной репликации ДНК предполагает, что материнская двойная спираль как целое выступает в качестве матрицы для синтеза дочерней спирали, состоящей из двух новых цепочек. Согласно гипотезе дисперсной репликации, при репликации через каждые 5 нуклеотидных остатков вносятся разрывы в цепь ДНК, которые «зашиваются» после того, как излишнее напряжение снимется с молекулы. В результате дочерняя (вновь синтезируемая цепь) состоит из чередующихся старых и новых участков длиной по 5 нуклеотидных остатков. То же верно и для материнской цепи.

Полуконсервативный характер репликации доказан в эксперименте Мезельсона-Сталя в 1958 году. Мезельсон и Сталь показали, что если вырастить несколько поколений бактерий Escherichia coli в среде, богатой ¹⁵N или ¹⁴N, затем центрифугировать их ДНК в градиенте плотности хлористого цезия, то окажется, что более тяжёлая 15N-ДНК останавливается ближе ко дну центрифужной пробирки, чем 14N-ДНК.

Для того чтобы установить механизм репликации, E. coli, которые в течение нескольких поколений росли в ¹⁵N-содержащей среде (а значит их ДНК содержала только ¹⁵N) были перенесены в ¹⁴N-содержащую среду, где им было позволено разделиться только один раз. Плотность выделенной из этих клеток ДНК оказалась больше плотности ДНК бактерий, выращенных в среде, богатой ¹⁴N, но меньше плотности ДНК бактерий, выращенных в ¹⁵N среде. Это противоречило гипотезе о консервативном характере репликации ДНК, при котором ДНК разделились бы на две фракции с высокой и низкой плотностью, но не с промежуточной.

Однако полученный результат не исключал дисперсный механизм репликации. Чтобы выяснить, какой из механизмов верен, была проанализирована плотность ДНК второго поколения бактерий. По гипотезе дисперсной репликации плотность ДНК второго поколения бактерий должна быть одинаковой для всех молекул и занимать промежуточное положение между плотностью ДНК клеток первого поколения и плотностью самой лёгкой ДНК. Оказалось, однако, что клетки второго поколения содержали примерно равные количества лёгких и гибридных ДНК. Этот факт позволил исключить гипотезу дисперсного механизма репликации

Репликация как у про-, так и у эукариот начинается с образования особой структуры – репликативного глаза (репликационного глаза), где две цепи родительской ДНК отделяются друг от друга, и в местах расхождения полинуклеотидных цепочек начинается синтез дочерних цепей. Это приводит к появлению в молекуле ДНК петли в виде участка, расплетенного на две отдельные нити. Участок нуклеиновой кислоты, с которого начинается репликация называется точкой инициации репликации или ориджином (локус ori, от англ.: origin). Этот участок содержит последовательность, состоящую из 300 нуклеотидов. Именно эта последовательность узнается специальными белками, необходимыми для начала репликации. Область расхождения двойной спирали ДНК на одинарные полинуклеотидные цепочки в зонах репликации называют репликативной вилкой (репликационной вилкой). Постепенное разъединение цепей молекулы ДНК происходит при разрыве водородных связей между пуринами и пиримидинами.

Репликация может происходить либо в одном, либо в дух направлениях. При однонаправленной репликации (вдоль ДНК движется одна репликационная вилка. При двунаправленной репликации от точки начала в противоположных направлениях расходятся две репликативные вилки.

На определённом расстоянии от точки инициации молекула ДНК содержит участок, в котором репликация останавливается. Этот участок ДНК носит название точки терминации (точки окончания)репликации. Участок ДНК от точки инициации репликации до точки ее окончания образует единицу репликации – репликон. Начавшись в точке инициации, репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован. Кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток имеют один локус ori и представляют собой целиком отдельные репликоны. Эукариотические хромосомы содержат большое число репликонов. Поэтому удвоение молекулы ДНК, начинается в нескольких точках. Это ускоряет процесс репликации больших молекул ДНК эукариот. В разных репликонах удвоение может идти в разное время или одновременно.

Для осуществления репликации цепи материнской ДНК должны быть отделены друг от друга, чтобы стать матрицами, на которых будут синтезироваться комплементарные цепи дочерних молекул (рис. 2.18). Такое разделение комплементарных полинуклеотидных цепочек происходит с помощью фермента геликазы. Двойная спираль ДНК в определённой зоне (локус ori) расплетается. К образующимся при этом одноцепочечным участкам прикрепляются специальные белки. Их называют дестабилизирующими белками или SSB-белками (от англ.: single-strand DNA-binding proteins). Молекулы этих белков выстраиваются вдоль полинуклеотидных цепей, растягивают их остов. В результате азотистые основания разъединённых цепей становятся доступными для связывания с комплементарными нуклеотидами, поступающими из нуклеоплазмы.

Геликаза, разделяя спирально закрученные цепи материнской ДНК, вызывает появление супервитков (т.е. сильную спирализацию молекулы ДНК) перед репликационной вилкой. Супервитки ДНК возникают потому, что при расхождении каждых 10 пар нуклеотидов, образующих один виток спирали, материнская ДНК должна совершить один полный оборот вокруг своей оси. Следовательно, для продвижения репликационной вилки верёд вся молекула ДНК перед ней должна была бы быстро вращаться. Такое вращение потребовало бы большой затраты энергии. В действительности же вращения не происходит благодаря действию особого фермента – ДНК-топоизомеразы. Топоизомераза разрывает одну из цепей ДНК и совершает оборот вокруг второй (целой) цепи как вокруг оси вращения (рис. 2.19). Это устраняет супервитки и ослабляет накопившееся напряжение в двойной спирали ДНК. После снятия избыточного напряжения фермент восстанавливает разорванную цепь.

 

В каждой репликативной вилке при участии фермента ДНК-полимеразы синтезируется ДНК двух новых дочерних молекул. В процессе синтеза ДНК репликационная вилка движется вдоль материнской спирали, захватывая все новые зоны. Освобождающиеся водородные связи нуклеотидов двух разъединённых родительских цепей служат своеобразными магнитами, притягивающими из нуклеоплазмы свободные нуклеотиды, которые находятся в нуклеоплазме в виде дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ. Комплементарный нуклеозидтрифосфат образует водородные связи с комплементарным основанием материнской цепи ДНК. Затем при участии фермента ДНК-полимеразы он связывается фосфодиэфирной связью с предшествующим нуклеотидом вновь синтезируемой цепи, отдавая при этом неорганический пирофосфат.

ДНК-полимераза присоединяет очередной нуклеотид к ОН-группе только в 3'-положении предшествующего нуклеотида. Поэтому цепь постепенно удлиняется на ее 3'-конце.Особенностью ДНК-полимеразы является ее неспособность начать синтез новой полинуклеотидной цепи путем простого связывания двух нуклеозидтрифосфатов. Ей необходим 3'-ОН-конец какой-либо полинуклеотидной цепи, спаренной с матричной цепью ДНК, к которой ДНК-полимераза может лишь добавлять новые нуклеотиды. Такую полинуклеотидную цепь называют праймером или затравкой. Праймером для начала синтеза цепи ДНК является короткая последовательность РНК, образуемая на ДНК при участии фермента РНК-праймазы. Длина праймеров варьирует от 10 до 100 нуклеотидов.

Так как ДНК-полимераза способна осуществлять сборку полинуклеотида только в одном направлении – от 5'- к 3'-концу, то процесс репликации протекает на антипараллельных цепях-матрицах ДНК по-разному. На одной из матриц (3'→5') сборка новой цепи происходит непрерывно от 5'- к 3'-концу и она постепенно удлиняется на 3'-конце. Другая цепь, синтезируемая на матрице (5'→3'), должна расти от 3' к 5'-концу, но это противоречит направлению действия фермента ДНК-полимеразы. В настоящее время установлено, что синтез второй цепи ДНК осуществляется также в направлении от 5'- к 3'-концу, но не непрерывно, а многочисленными короткими фрагментами, получившими название фрагментов Оказаки.

Суть репликации второй цепи ДНК фрагментами Оказаки состоит в следующем. Синтез каждого нового фрагмента Оказаки начинается с образования РНК-затравки. После того, как образуется новый фрагмент ДНК, он должен быть соединён с ранее синтезированной дочерней цепью полинуклеотидов. Но перед этим у самого последнего из синтезированных фрагментов должна быть удалена затравка. Удаляет эту затравку и присоединяет новый фрагмент к ранее синтезированной цепи фермент ДНК-лигаза.

Из-за различий в механизмах синтеза копий на двух разных цепях материнской ДНК репликативная вилка асимметрична. Из двух синтезируемых дочерних цепей одна строится непрерывно. Поэтому её синтез идет быстрее. Поэтому эту цепь называют лидирующей. Синтез другой цепи идет медленнее, потому что она собирается из отдельных фрагментов, требующих многократного формирования, а затем удаления РНК-затравки. Поэтому эту цепь называют запаздывающей (отстающей). Хотя на ней отдельные фрагменты образуются в направлении 5'→3', в целом эта цепь растет в направлении 3'→5'.

Процесс репликации завершается образованием двух дочерних молекул ДНК. Их нуклеотидные последовательности идентичны нуклеотидным последовательностям материнской двойной спирали ДНК. Завершение репликации происходит в специальных участках ДНК. У E. coli они называются ter -сайтами и содержат короткую последовательность (около 23 пар) нуклеотидов.

Для окончания репликации ДНК необходим специальный белок. У E. coli он кодируется геном tus. Этот белок распознаёт терминаторную последовательность, связывается с ней и останавливает дальнейшее продвижение вилки репликации.

К настоящему времени установлено, что процессы, идущие в репликативной вилке, ещё более сложны. ДНК-геликаза, две ДНК-полимеразы на обоих дочерних цепях и праймаза на отстающей цепи образуют единый полиферментный комплекс – реплисому. Отстающая цепь изгибается таким образом, что её ДНК полимераза комплексирует с ДНК-полимеразой лидирующей цепи. Этот изгиб подводит 3′-конец каждого уже синтезированного фрагмента Оказаки к тому участку, где начинается синтез нового фрагмента Оказаки. Комплекс геликаза-праймаза-полимераза движется вместе с вилкой репликации и синтезирует новые РНК-праймеры. ДНК полимераза на отстающей цепи продвигается вперёд вместе с репликационной вилкой и многократно используется для синтеза фрагментов Оказаки. Таким образом, ДНК синтезируется одинаково эффективно на обеих материнских цепях ДНК (матрицах). Эта схема репликации ДНК получила название «модели тромбона».

У бактерий молекула ДНК замкнута в кольцо. Репликация таких, замкнутых в кольцо, молекул имеет ряд характерных особенностей и может происходить двумя путями. При репликации первым путём синтез дочерних цепей происходит при сохранении кольцевой структуры молекулы ДНК. На электронномикроскопических фотографиях реплицирующаяся молекула напоминает своей формой греческую букву Ө (тета). После того как молекула ДНК будет реплицирована полностью, обе кольцевые копии оказываются «продеты» одна в другую, как два кольца цепи. Они должны быть разъединены. Этот процесс осуществляет топоизомераза II. Фермент разрезает одну из кольцевых молекул, сквозь разрыв выводит петлю неразорванной молекулы, а затем воссоединяет концы разрезанной молекулы, вновь превращая её в кольцо.

Второй путь, по которому может осуществляться репликация кольцевых молекул ДНК, получил название «катящегося кольца». Так образуется много новых молекул вирусных ДНК, половой процесс у бактерий и амплификация генов. В этом случае репликация начинается со специфического разрыва одной материнской цепи двойной спирали ДНК. Это приводит к появлению однонитевых 5'- и 3'-концов. Конец 5' вытесняется из двойной спирали. По мере раскручивания молекулы величина освобожденной одноцепочечной матрицы от конца 5' увеличивается. На ней происходит синтез комплементарной дочерней нити ДНК. В результате образуется постепенно увеличивающийся свободный «хвост».

Одновременно с освобождением с конца 5' одноцепочечной матрицы освобождается однонитевая матрица на кольцевой одинарной нити ДНК. Синтез на кольцевой нити может идти на протяжении нескольких оборотов молекулы. В результате длина образованной линейной молекулы может превышать длину одного генома. Многократно повторенный синтез копии цепи на кольцевой нити ДНК приводит к появлению линейная нить, содержащей несколько повторов одного и того же генома. Такую нить называют конкатемером. Она разрезается специальными ферментами (рестриктазами) на куски, каждый из которых равен длине хромосомы (генома). После появления таких кусков они замыкаются в кольцевые хромосомы.

Репарация ДНК

 

Организмы и их клетки на протяжении всей своей жизни, а также в ряду поколений должны сохранять свои основные свойства и признаки. Поэтому при делении клеток репликация наследственного материала должна происходить очень точно. Кроме того, наследственный материал должен быть очень устойчивым к внешним воздействиям, способным нарушать структуру ДНК. Но, поскольку случайные нарушения структуры ДНК в процессе репликации и функционирования всё-таки возможны, то должны существовать механизмы, исправляющие эти нарушения. Они получили название репарационных механизмов или просто – репарации.

В зависимости от периода клеточного цикла, в течение которого происходит репарация повреждений ДНК, её подразделяют на пострепликативную и дорепликативную. Пострепликативная репарация – это ферментативный процесс исправление ошибок в ДНК, идущий сразу после её синтеза.

Нарушения структуры молекулы ДНК могут возникать не только в процессе репликации, но и на стадии нереплицирующейся двуспиральной молекулы ДНК. Чтобы сохранять структуру ДНК нормальной, и не позволять повреждениям ДНК реализоваться в виде мутаций, клетка должна исправлять повреждения до того, как ДНК начнёт реплицироваться. Устранение повреждений в двунитевой ДНК с помощью специальных ферментов до начала нового цикла репликации называется дорепликативной репарацией.

По особенностям биохимических механизмов репарации различают прямую, эксцизионную, рекомбинационную и SOS-репарацию. Каждая из них реализуется с помощью определенного набора ферментов.

I Прямая коррекция мутационных повреждений

Прямая репарация – это наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы ферменты, способные быстро (обычно – в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов.

1.Самокоррекция ДНК-полимеразой

Самокоррекция – это отщепление ДНК-полимеразой ошибочно включенного в цепь ДНК нуклеотида, не спаренного с матрицей и присоединение комплементарного нуклеотида. ДНК-полимераза отбирает нужные нуклеотиды из имеющихся в нуклеоплазме нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), присоединяет их к матричной цепи ДНК и химически связывает в растущую дочернюю цепь. Частота включения неправильных нуклеотидов на этой стадии составляет 1∙10^–5 пар оснований. Это происходит из-за возникновения химически измененных форм азотистых оснований, которые образуют «незаконные» пары с основаниями материнской цепи. Примером может служить измененная форма цитозина, которая вместо гуанина связывается водородными связями с аденином. В результате этого в растущую цепь ДНК включается ошибочный нуклеотид. Быстрый переход измененной формы такого основания в обычную форму нарушает его связывание с матрицей. В результате появляется неспаренный 3'-ОН-конец растущей цепи ДНК. В этой ситуации включается механизм самокоррекции, осуществляемый ДНК-полимеразой. Было установлено, что большинство бактериальных полимераз кроме полимеризующей активности в направлении 5'→3' имеет ещё и экзонуклеазную активность в направлении 3'→5'. Если встраивается «неправильный» нуклеотид, ошибка чаще всего (хотя и не всегда) распознается полимеразой, вероятно, из-за того, что в этом месте в двойной спирали образуется пузырь или впячивание. «Неправильный» нуклеотид не может сформировать водородную связь с комплементарным основанием. Поэтому полимераза не может добавить новый нуклеотид к растущему 3'-ОН-концу. Процесс репликации останавливается до тех пор, пока «неправильный» нуклеотид не будет удален полимеразой, и на его место ею не будет поставлен нужный. В результате самокоррекции частота ошибок снижается в 10 раз (с 10^–5 до 10^–6). У эукариотических ДНК-полимераз 3'→5'-экзонуклеазной активности не обнаружено.

2. Фотореактивация

Если микроорганизмы облучить ультрафиолетовым (УФ) светом в очень большой дозе – они погибнут. Происходит это из-за того, что в результате УФ-облучения в ДНК происходят химические изменения тиминов, расположенных рядом. Они образуют друг с другом 4 ковалентные связи, формируя димеры. В результате этого нарушается считывание информации с ДНК и её репликация.

В 1949 г. было обнаружено, что освещение актиномицетов, бактериофага и парамеций видимым светом восстанавливает их жизнеспособность после УФ-облучения в летальных дозах. Это явление было названо фотореактивацией. Тиминовые димеры, возникшие в результате УФ-облучения, под действием видимого света разрушаются, и тимины возвращаются к своей исходной форме.

Фотореактивацию катализирует фермент фотолиаза. Этот фермент активируется фотоном света и расщепляет димер на исходные составляющие. Однако не все тиминовые димеры могут быть фотореактивированы; их исправляют другие репарационные механизмы Фотолиаза обнаружена у прокариот и у низших эукариот. У человека фотолиаза не найдена.

3. Репарация алкилирующих повреждений

Присоединение к нуклеотидам алкильных или метильных групп приводит к химическим изменениям нуклеотидов и, следовательно, генетическим повреждениям ДНК. Такие повреждения репарируются путём удаления этих групп специфическими ферментами. Следует заметить, что в этой репарирующей системе модифицированное основание не удаляется из ДНК. В подобных случаях фермент распознает метилированное азтистое основание в ДНК и удаляет метильную группу, превращая основание в исходную форму.

4. Репарация полинуклеотидлигазой

Многие факторы, например, ионизирующее излучение, могут вызывать однонитевые разрывы ДНК. Эти разрывы устраняются прямой репарацией другого типа – с помощью фермента ДНК-полинуклеотидлигазы. Этот фермент осуществляет прямое воссоединение разорванных концов в молекуле ДНК.