Молекулярно-биологические (молекулярно-генетические) методы

С помощью м олекулярно-генетического исследования, в частности, полимеразной цепной реакции (ПЦР), можно выявить в любом субстрате даже следы генетического материала микробного или вирусного происхождения По чувствительности и специфичности этот метод значительно превышает все другие, используемые для лабораторной диагностики

Суть метода – в том, что он позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации любого организма среди огромного количества других участков и многократно размножить его. Метод основан на принципе естественной репликации ДНК. Он включает расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное их дополнение. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. Промарки- ровав такими блоками специфический только для данного вида (но не для других видов) участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок и выявить его в реакции иммуноэлектрофореза.

Достоинства метода: высокая чувствительность и специфичность.

Недостатки метода: требуется специальное оборудование и наличие высоко квалифицированных специалистов.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПИОГЕННЫХ КОККОВ

Кокки - это многочисленная и широко распространенная группа микроорганизмов. Несмотря на свою многочисленность, болезнетворными для человека являются только пять видов кокков, которые объединены одним общим названием – пиогенные (гноеродные) кокки. Однако это название не совсем соответствует истине, т.к., кроме гнойных заболеваний, они вызывают и другие тяжелые поражения, например, скарлатину, ревматизм и другие.

В группу пиогенных кокков входят: стафилококки, стрептококки, пневмококки, гонококки и менингококки. Они являются представителями семейств: Micrococcaceae, Streptococcaceae, Neisseriaceae.

Все кокки имеют правильную или относительно правильную шаровидную форму, неподвижны (не имеют жгутиков), спор не образуют. По Граму стафилококки, стрептококки и пневмококки окрашиваются положительно, а гонококки и менингококки - отрицательно. В мазках стафилококки располагаются гроздьями, стрептококки – цепочками, менингококки и гонококки - попарно.

Патогенные кокки отличаются по степени паразитирования и биохимической активности. Паразитизм (зависимость от макроорганизма) повышается от стафилококков к стрептококкам, к менингококкам, к гонококкам. В то же время, с повышением паразитарных свойств кокков возрастает их требовательность к условиям культивирования при одновременном снижении ферментативной активности и устойчивости во внешней среде.

СТАФИЛОКОККИ

История открытия. Стафилококков обнаружил впервые Р.Кох (1878), выделил культуру из гноя фурункула Л.Пастер (1880), подробно изучил Ф.Розенбахом (1884).

 

Т аксономия.

Семейство– Micrococcaceae

Род – Staphylococcus. Включает 19 видов, из них только три вида экологически связаны с организмом человека.

Виды: S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus. Заболевания чаще вызывают золотистые, реже – эпидермальные и еще реже - сапрофитные стафилококки.

Морфология.

Форма - правильного шара, диаметр 0,5 – 1,5 мкм, в мазках располагаются в виде гроздьев винограда (что определяется характером деления кокков в трех взаимно перпендикулярных плоскостях), по Граму окрашиваются положительно. Золотистые стафилококки образуют капсулу полисахаридной природы.

Культуральные свойства.

Стафилококки - факультативные анаэробы (но лучше растут в присутствии кислорода), хемоорганотрофы с окислительным и бродильными типами метаболизма. Оптимальное значение рН 7,2 – 7,4, температура 37⁰С. На свету в присутствии кислорода и при комнатной температуре образуют липохромные, растворимые в органических растворителях пигменты: белый, золотистый, лимонно-желтый. Не требовательны к питательным средам, хорошо растут на простых средах. На МПБ дают рост в виде равномерного помутнения с последующим образованием рыхлого осадка. На плотной питательной среде формируют круглые, гладкие, блестящие, в ряде случаев пигментированные колонии диаметром от 2 до 4 мм. На кровяном агаре патогенные стафилококки вызывают гемолиз. Особенностью стафилококков является их способность выживать и размножаться в солевой среде (не погибают при концентрации NaCl до 15%). С учетом этой особенности созданы дифференциально-диагностические среды: ЖСА (желточно- солевой агар) и накопительный солевой бульон.

Биохимические свойства.

Стафилококки - биохимически активные кокки Разлагают большинство углеводов до кислоты без газа. В анаэробных условиях патогенные стафилококки сбраживают глюкозу и манит, что является важным дифференциально-диагностическим признаком. Разжижают желатин в виде воронки, восстанавливают нитраты, образуют H₂S и аммиак. Индол не образуют.

 

Антигенная структура.

Стафилококки обладают разнообразными антигенами, локализованными, в основном, в клеточной стенке (пептидогликан, белок А, расположенный снаружи пептидогликана, тейхоевые кислоты). Золотистый стафилококк имеет капсульный антиген, имеющий сложное химическое строение. Он состоит из уроновых кислот, моносахаридов и аминокислот. Выраженной антигенной активностью обладает α-токсин. Кроме названных, у стафилококков описаны и типоспецифические антигены. По системе Pillet с помощью типовых адсорбированных сывороток установлен 21 серотип (1, 2,3,14,18 являются основными). Всего у стафилококков выявлено примерно 30 белковых антигенов. Однако в практике для серотипирования они не используются. Типирование проводят посредством бактериофагов.

Факторы патогенности.

Стафилококк вырабатывает много продуктов с выраженными токсическими свойствами. Вероятно, никакой другой микроб не продуцирует их в таком количестве. Среди них экстрацеллюлярные токсины, (мембранотоксины, гистотоксины, энтеротоксины), ферменты патогенности, структурные элементы и химические соединения. Все они, в той или иной степени, обусловливают болезнетворность и вирулентность микроба. Однако ни один штамм не способен вырабатывать все токсические продукты сразу.

Токсины. Стафилококки синтезируют ряд токсинов, отличающихся друг от друга по механизму действия

Мембранотоксины- это экзотоксины, действующие непосредственно на клеточную мембрану, вследствие чего происходит лизис эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, макрофагов, и развивается поражение многих тканей. Действием мембранотоксинов, вероятно, объясняются фатальные исходы многих случаев стафилококковых инфекций. Они образуют каналы в цитоплазматической мембране эритроцитов, лейкоцитов, макрофагов и других клеток, что приводит к нарушению осмотического давления и лизису соответствующих клеток. Ранее их называли гемолизинами, полагая, что они лизируют только эритроциты. Мембранотоксины отличаются друг от друга по антигенным свойствам, мишеням их действия и по другим свойствам.

α-токсин, обладает гемолитической активностью, дермотонекротическими и кардиотоксическими свойствами.. Он представляет собой белок с выраженными иммуногенными свойствами. Из него получают анатоксин, используемый для лечения и профилактики стафилококковых инфекций.

β-токсин наряду с мембраноповреждающим действием на эритроциты и соединительнотканные клетки, угнетает хемотаксис полиморфно-ядерных лейкоцитов.

Χ-токсин разрушает эритроциты, лейкоциты и клетки соединительной ткани.

Гистотоксины, например, энтеротоксин - непосредственно внеклеточный токсин, его вырабатывают около 50% коагулазоположительных штаммов он вызывает в большинстве случаев пищевые отравления. Токсин действует на рвотный центр центральной нервной системы. Продукция токсина обусловлена фаговой конверсией. Различают 5 типов токсина – А, В, С, D, E. Накопление энтеротоксина в зараженной пище приводит к пищевому отравлению с синдромом гастроэнтерита, который не является инфекцией в обычном понимании этого термина, скорее это - токсемия. Присутствие токсина в подозреваемой пище можно установить иммунологически, например, в реакции преципитации.

Цитотоксин– один из наиболее важных факторов вирулентности стафилококков, вызывает аггрегацию тромбоцитов и избирательно действует на гладкую мускулатуру мелких вен.

Эксфолиатин (эксфолиативный токсин) – это токсин, продукция которого обусловлена плазмидой. Избирательно повреждает некоторые клетки кожи таким образом, что обширные участки кожного покрова могут отслаиваться полностью. Особенно чувствительны к действию токсина новорожденные и маленькие дети. Это поражение получило названиея:"синдром ошпаренной кожи", пузырчатка новорожденного, импетиго, генерализованная скарлатиноподобная сыпь. Чаще индуцируется стафилококками 2-й фагогруппы.

Экзотокси н, вызывающий синдром токсического шока. Последний чаще вызывается энтеротоксином стафилококка серотипа В, являющегося обитателем мочевых путей женщин. Механизм действия заключается в гиперактивации моноцитов и макрофагов с последующей гиперпродукцией ИЛ-1, ТНФ (туморнекротизирующего фактора). Таким образом, данный токсин обладает всеми свойствами, присущими суперантигенам. Он представляет собой белок, образование которого кодируется хромосомными и плазмидными генами (профагами), находящимися в бактериальной хромосоме. Наряду с опосредованным действием, данный экзотоксн оказывает прямое действие на кровеносные капилляры, увеличивая их проницаемость. Заболевание часто заканчивается летальным исходам

Ферменты патогенности. Из экзоферментов, продуцируемых., главным образом, S.aureus, существенную роль в патогенезе заболевания играют плазмокоагулаза, гиалуронидаза,лецитиназа, фибринолизин, ДНК-за.

Плазмокоагулаза (коагулаза) – важный экстрацеллюлярный фермент, продуцируемый только некоторыми стафилококками (коагулазоположительны-

ми); свертывая плазму, они вызывают образование сгустка плазмы. В лаборатории определение коагулазы используется как одно из достоверных доказательств патогенности выделенного штамма. У невирулентных штаммов попытки обнаружить коагулазу обычно заканчиваются неудачей. Эти штаммы обозначают как коагулазоотрицательные. При наличии данного фермента и проявлении его действия отдельные кокки оказываются покрытыми слоем фибрина и, таким образом, они надежно защищены от атаки фагоцитов. Способность к продукции коагулазы коррелирует с наличием у этих штаммов и других токсических продуктов. Коагулазоположительные стафилококки также могут иметь фактор склеивания – это связанная с клеткой, но антигенно отличающаяся форма коагулазы, вызывающая быстрое склеивание клеток, эмульгированных в капле плазмы.

Гиалуронидаза(фактор распространения, фактор инвазии), ее вырабатывают более 90% патогенных стафилококков, она повышает проницаемость тканей для кокков и их токсических субстанций. Вызывает деградацию гиалуроновой кислоты, которая соединяет клетки тканей.

Лецитиназа - разрушает лецитин в составе клеточных мембран лейцкоцитов и других клеток, способствует лейкопении.

Фибринолизин (стафилокиназа) растворяет сгустки фибрина и, соответственно, способствует распространению местной, вначале ограниченной, инфекции.

ДНК-за (нуклеаза) имеется у 90 – 96% S.aureus, расщепляет ДНК и РНК. Нуклеаза S.aureus термостабильна, нуклеаза коагулазоотрицательных стафилококков – термолабильна..

Липазы стафилококка – это ферменты, которые разрушают липиды клеточных структур и липопротеины крови. Стафилококки утилизируют метаболиты кожных структур и потому способны интенсивно колонизировать (заселять) поверхность кожи. Образование липазы дает этому микробу способность к инвазии здоровой кожи и подкожной клетчатки с формированием локальных абсцессов. Штаммы без липазы чаще обусловливают генерализованные инфекции.

Структурные и химические компоненты бактериальной клетки. К структурным и химическим компонентам, являющимся факторами патогенности у стафилококков, относят: пили первого типа, адгезины, капсулу, белок А.

Пили первого типа – участвуют в адсорбции возбудителя на рецепторах чувствительных клеток.

Адгезины. А дгезивная способность стафилококков выражена в отношении клеток и межклеточных веществ различных тканей (эпителий, фибронектин, коллаген,, фибриноген и др). При этом адгезия стафилококков на разных клетках и субстратах происходит за счет определенных адгезинов. Так, тейхоевые кислоты ответственны за адгезию на эпителиальных клетках. Стафилококки не прилипают к тромбам, если они покрыты гноем, вследствие блокирования фибронектиновых рецепторов. Капсульные полисахариды также способствуют адгезии, в частности к эндопротеазам. Важнейшим свойством стафилококков является индукция большого количества иммуноцитокинов, что приводит к возникновению очага воспалени и образованию абсцессов.

Капсула защищает микробыот фагоцитоза(капсульные полисахариды подавляют активность фагоцитирующих клеток).

Белок А, содержащийся в клеточной стенке S.aureus, чаще имеется у коагулазоположительных и ДНК-аза положительных стафилококков, такие штаммы более устойчивы к антибиотикам. Белок А обладает антифагоцитарными свойствами. Он связывается с фибронектином – адгезивным гликопротеином, покрывающим поверхность клеток и находящимся в базальных мембранах основным веществом соединительной ткани, а также циркулирующим в крови. Выраженным токсическим действием не обладает. Таким образом, белок А участвует в адгезии и обладает агрессивными свойствами. Кроме того, белок А реагирует с F_с-фрагментом IgG, образующийся комплекс, активирует комплемент и вызывает повреждение тромбоцитов.

Резистентность.

Стафилококки устойчивее других бактерий к действию света, высушивания, экстремальных температур и химических агентов. Они выдерживают 60°С в течение часа, а отдельные штаммы - даже 80°С в течение 30 минут, хотя большинство вегетативных форм бактерий погибают при воздействии 60°С в течение 30 минут. Благодаря своей устойчивости к высушиванию, стафилококки могут переноситься с частицами пыли, могут недели и месяцы сохраняться в высохшем гное или мокроте. Эти микробы устойчивы к действию фенола и большинству других дезинфектантов, чувствительны к основным красителям. Устойчивы в солевой среде (не погибают при концентрации NaCl до 15%). В связи с этим способны сохраняться в консервированных продуктах (пресервах). В продуктах питания, сохраняемых путем соления, стафилококки могут расти и продуцировать энтеротоксин. Имеют тенденцию к формированию резистентности к сульфаниламидам и антибиотикам. Около 90% штаммов Staphylococcus aureus резистентны к пенициллину.

Эпидемиология.

Стафилококки в норме обитают на коже человека, а также на слизистой ротовой полости, глотки и носа. Они могут находиться здесь постоянно, пока однажды не преодолеют кожный или слизистый барьер и не вызовут развитие болезни. В другом случае они проникают через неповрежденную кожу в волосяные фолликулы и протоки сальных желез. В норме способность стафилококка к инвазии и резистентность хозяина хорошо сбалансированы, поэтому инфекция не развивается, пока не создастся ситуация, когда встречаются высоковирулентный микроб или макроорганизм со сниженной резистентностью. Как правило, развивается локальный процесс (абсцесс или фурункул) без распространения инфекции. Но в части случаев микроб выходит за пределы локальной инфекции, попадает в кровоток и поражает разные ткани и органы тела.

Источник инфекции – больной или бактерионоситель.

Пути передачи –аэрогенный, контактный, алиментарный.

Механизм передачи - преимущественно контактный. Например, через руки персонала в больнице. Персонал подвергается риску стать носителями, в этом случае стафилококк может длительно находиться у них на слизистой носа. Носители могут стать источниками инфекции.

 

Роль в патологии

Некоторые стафилококки непатогенны для человека, другие (S.aureus) вызывают тяжелые инфекции. S.epidermidis, хотя иногда и вызывает легкие, ограниченные поражения, в общем, относится к непатогенным, за исключением некоторых необычных медицинских ситуаций, например, при введении в тело с лечебной целью технических устройств, чужеродных для тканей организма. Обычно S.epidermidis является частой причиной эндокардита, развивающегося при протезировании сердечных клапанов и инфекций, осложняющих ортопедическое протезирование или нейрохирургическое шунтирование.

Хорошо известны стафилококковые инфекции кожи и поверхностных тканей тела, такие как пиодермии, фурункулы, абсцессы, карбункулы, паронихии, импетиго (impetigo contagiosa) и инфекционные осложнения хирургических ран. Клиника инфекции кожных покровов зависит от возраста больного. Например, "синдром ошпаренной кожи" наблюдается у маленьких детей.

Стафилококки также способны вызывать заболевания целых систем, и поражаться могут практически все органы и ткани. Они могут быть одной из причин пневмонии, гнойного плеврита, эндокардита, менингита, абсцесса мозга, послеродовой лихорадки, флебита, цистита и пиелонефрита. Стафилококковая пневмония является фатальным осложнением эпидемического гриппа. Стафилококки являются наиболее распространенной причиной остеомиелита. Стафилококковые заболевания часто возникают в больницах, особенно у пациентов, уже серьезно больных. Например, стафилококковая пневмония – это суперинфекция, угрожающая больным, принимавшим большие дозы антибиотиков. Стафилококковая септицемия наблюдается в двух формах. Первая – это молниеносная глубокая токсемия, через несколько дней приводящая к смерти. Другая, более частая форма, длится дольше, сопровождается развитием метастазирующих абсцессов в разных частях тела, но не является необратимой. Стафилококковая септицемия может быть первичной, но чаще это результат вторичного проникновения в кровоток микроорганизмов из местного очага инфекции. Часто процесс начинается как тривиальное воспаление волосяного фолликула. Микроб может поступать в кровоток из инфицированной раны, из очага пневмонии или из инфицированного внутривенного катетера. Катетер внутри вены не должен оставаться дольше 3-4 дней из-за риска возникновения серьезной инфекции.

Поверхностные гнойники, фурункулы вокруг носа и губ легко осложняются септицемией, поэтому лучше избегать их травмирования. Так называемый "опасный треугольник" – это треугольный участок лица от углов рта, верхней губы и до верхней части носа. Из этой области возможно распространение инфекции непосредственно в полость черепа, что может быть опасным для жизни. Такое осложнение связано с особенностями анатомического строения этой части тела: отсутствие надежных механических барьеров, вены, не имеющие клапанов, которые бы затрудняли обратный ток крови, наличие мускулатуры, постоянно находящейся в движении. Даже при таких манипуляциях, как прокалывание ушей (в косметических целях), проводимых без соблюдения необходимой стерильности, есть опасность развития вторичной количестве токсин. Стафилококки могут вызывать иногда гнойно-воспалительные процессы у коров и лошадей. В случае развития мастита микроб может попасть в молоко. Могут возникнуть гнойничковые поражения кожи рук доярок. Возможно заражение других животных в стаде.