Забор анализа и способы его проведения
Определить наличие австралийского антигена в крови можно двумя основными методами: экспресс-диагностика и лабораторные серологические методы. Первые могут быть проведены в домашних условиях, вторые – исключительно в условиях специализированной лаборатории. Материалом для исследования при помощи специального одноразового экспресс-теста может быть кровь, полученная из пальца (капиллярная кровь). Такие тестовые реактивы для диагностики гепатита B каждый может приобрести в аптечной сети.
Лабораторное исследование отличается большей точностью и специфичностью по сравнению с экспресс-диагностикой, но техническое его выполнение требует специальных реактивов и установок.
В основном пользуются двумя методами серодиагностики HBsAg: РИА (радиоиммунный анализ) и РФА (реакция флюоресцирующих антител). Для их проведения обязательно набирается кровь из вены, поскольку для серологических методов диагностики нужна только ее жидкая часть – плазма. Ее получают после центрифугирования и отстаивания взятого на анализ образца крови.
Экспресс-диагностика
Определение HBsAg в крови при помощи специальных тестовых наборов для быстрой диагностики гепатита B в домашних условиях относится к методам качественного обнаружения. Это значит, что метод может ориентировочно указать, есть или нет в крови австралийский антиген. Он не дает информации о его количественных характеристиках и титрах. Если его результатом является обнаружение HBsAg, человек обязательно направляется на специализированное обследование в виде лабораторной серодиагностики.
Но методу экспресс-диагностики стоит отдать должное, поскольку он очень быстро и достоверно дает возможность определить типичные случаи инфицирования гепатитом B. Для его проведения используют, приобретенный в аптеке, набор. Дополнительно ничего не требуется, поскольку в его состав включено все необходимое для выполнения диагностической процедуры.
Сначала обрабатывают спиртовым раствором один из пальцев и высушивают кожу. При помощи ланцета или скарификатора она прокалывается. Для тестирования достаточно две-три капли полученной из прокола крови. Ее наносят на пористую поверхность тест-полоски. Непосредственное прикосновение пальца к полоске недопустимо, так как может привести к искажению результата. Полоска с кровью оставляется на одну минуту, после чего опускается в емкость, которая имеется в комплекте. Это нужно для того, чтобы промокнуть тест-полоску в буферный раствор, который вносится в емкость в объеме трех-четырех капель и оставляется в таком положении на 10-15 минут. По происшествии этого времени может проводиться оценка полученных результатов.
Набор для экспресс-диагностики вирусного гепатита В
Серологическая лабораторная диагностика
Метод используется очень давно и отличается высокой специфичностью и достоверностью. При его помощи может быть определен HBsAg уже с 3-5 недели с момента попадания вируса в кровь. Обычно, австралийский антиген циркулирует в крови около 3-х месяцев после начала заболевания. Но встречаются случаи пожизненного носительства антигена или здорового носительства вируса. Серологической диагностике доступно также обнаружение соответствующих антител анти-HBs. Они появляются с выздоровлением пациента (через 3-4 недели после исчезновения антигена). Их концентрация постоянно нарастает и сохраняется пожизненно, что обеспечивает стойкий долгосрочный иммунитет против вируса, вызывающего гепатит. Это очень важно для определения устойчивости организма после вакцинации или полноценного выздоровления.
Для анализа нужна венозная кровь, которую получают путем пункции одной из локтевых вен. Техника забора крови и подготовка типичная для всех анализов. Главное условие – анализ проводится исключительно натощак. Для исследования необходимо от 5 до 10 мл крови. На получение результата уходит один день.
Показания
Главным показанием для исследования крови на наличие HBsAg является желание человека пройти его. Для этого не нужны особые причины и поводы, поскольку распространенность гепатита B настолько широка, что исследование уже может носить скрининговое предназначение. Обязательно обследуются:
Женщины при беременности: постановка на учет в женскую консультацию и в предродовом периоде;
Все медицинские работники, особенно те, у которых имеется прямая связь с кровью пациентов (манипуляционные медсестры, фельдшера, хирурги, гинекологи и т.д.);
Лица, которым предстоит оперативное вмешательство;
Гепатит любой формы и цирроз печени;
Больные хронической формой вирусного гепатита B или здоровые носители вируса и антигена.
Интерпретация полученных результатов
При проведении экспресс-диагностики могут быть получены такие результаты:
· Наличие после теста только одной контрольной полоски. Такой результат считается отрицательным, а значит HBsAg не обнаружен и человек здоров;
· Наличие двух сигнальных полос на реактиве. Говорит о присутствии австралийского антигена в крови и о связи человека с вирусным гепатитом B. В таком случае необходимо дополнительное обследование;
· Наличие после теста одной полоски, но только тестовой. Реактив не действителен. Тест обязательно должен быть повторен.
При проведении серологической диагностики результаты бывают:
· HBsAg-не обнаружен (отрицательный). Это норма, и значит, что человек не болен гепатитом В;
· HBsAg-положительный. Это говорит, что организм исследуемого либо заражен активно размножающимся вирусом гепатита B, либо он является здоровым носителем антигена, либо переболел этим заболеванием. Для получения более детальной информации о состоянии противовирусного иммунитета и активности вируса проводятся дополнительные серологические исследования и расшифровка других маркеров этого заболевания;
· Ложноположительный и ложноотрицательный результат. Иногда может быть получен даже при серологической диагностике и связан с забором крови после плотного завтрака или до 4 недель с момента заражения, погрешностями лаборатории и реактивов.
ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это лабораторный метод исследования, в основе которого лежит так называемая амплификация, то есть способность создавать большое количество копий искомого небольшого участка ДНК в случае его обнаружении в исследуемом биологическом материале.
В ходе выполнения ПЦР анализа в медицинской лаборатории выполняется несколько шагов, которые повторяются в виде циклов в специальном аппарате, называемом амплификаторомили термоциклером:
· Первый шаг при ПЦР анализе – это денатурация, то есть расщепление двухцепоченой ДНК на 2 отдельные цепочки посредством повышения температуры исследуемого биологического материала в амплификаторе (термоциклере).
· На втором шаге ПЦР анализа исследуемый материал немного остужают, добавляя к нему праймеры – короткие последовательности азотистых оснований, которые специфично распознают и связываются с искомыми последовательностями в молекуле ДНК. Этот шаг называется отжигом.
· После того, как 2 праймера присоединились к каждой из 2-х цепей ДНК, начинается третий шаг – элонгация. На этом шаге при помощи фермента ДНК-полимеразы (обычноTaq полимеразы – ферменты, продуцируемые организмами Thermues aquaticus, которые живут в очень горячих водах гейзеров и горячих подземных источниках) происходит достраивание участка ДНК от присоединившегося ранее праймера. Таким образом, на участке в области праймеров каждой из цепей ДНК образуется вторая комплементарная первой цепь ДНК.
Далее эти шаги повторяются в виде множества циклов, что ведёт к удвоению количества копий искомого участка ДНК (например, участка, специфичного для определенного вируса) на каждом таком цикле.
В результате за 30-40 циклов, осуществляющихся в течение нескольких часов, образуются миллиарды копий искомой последовательности ДНК. Далее происходит определение наличия этих копий в образце. Разумеется, это происходит только в случае действительного наличия и обнаружения искомой последовательности в исследуемом биологическом материале при помощи праймеров на 2 шаге ПЦР анализа.
Обнаружение вируса гепатита В методом ПЦР (качественно)
Вирус гепатита В в крови в норме отсутствует.
Качественное определение вируса гепатита В методом ПЦР в крови позволяет подтвердить наличие вируса в организме больного и тем самым устанавливает этиологию заболевания.
Данное исследование дает полезную информацию для диагностики острого вирусного гепатита В в инкубационном и раннем периоде развития заболевания, когда основныесерологические маркеры в крови у пациента могут отсутствовать. Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Аналитическая чувствительность метода ПЦР составляет не менее 80 вирусных частиц в 5 мкл, прошедшей выявление ДНК пробы, специфичность – 98%.
Этот метод имеет важное значение для диагностики и мониторинга течения хронического ВГВ. Примерно 5-10% случаев цирроза и других хронических заболеваний печени обусловлены хроническим носительством вируса гепатита В. Маркерами активности таких заболеваний является наличие HBeAg и ДНК вируса гепатита В в крови.
Метод ПЦР позволяет определять в крови ДНК вируса гепатита В как качественно, так и количественно. Определяемым фрагментом в обоих случаях служит уникальная последовательность ДНК гена структурного белка вируса гепатита В.
Обнаружение ДНК вируса гепатита В в биоматериале с помощью ПЦР необходимо для:
разрешения сомнительных результатов серологических исследований;
выявление острой стадии заболевания по сравнению с перенесенной инфекцией или контактом;
контроля эффективности противовирусного лечения.
Исчезновение ДНК вируса гепатита В из крови – признак эффективности терапии
Обнаружение вируса гепатита В методом ПЦР (количественно)
Этот метод дает важную информацию об интенсивности развития заболевания, об эффективности лечения и о развитии резистентности к активным препаратам.
Для диагностики вирусного гепатита методом ПЦР в сыворотке крови применяются тест-системы, чувствительность которых составляет 50-100 копий в пробе, что позволяет детектировать вирус при его концентрации 5 Х 10^3 -10^4 копий/мл. ПЦР при вирусном гепатите В безусловно необходима для суждения о вирусной репликации.
Вирусную ДНК в сыворотке крови обнаруживают у 50% больных при отсутствии HBeAg. Материалом для выявления ДНК вируса гепатита В могут служить сыворотка крови,лимфоциты, гепатобиоптаты.
Оценку уровня виремии осуществляют следующим образом:
менее 2.105 копий/мл (менее 2.105 МЕ/мл) – низкая виремия;
от 2.105 копий/мл (2.105 МЕ/мл) до 2.106 копий/мл (8.105 МЕ/мл) – средняя виремия;
более 2.106 копий/мл – высокая виремия.
"Не обнаружено" – ДНК вируса гепатита В не обнаружена или значение ниже предела чувствительности метода (200 копий/мл = 90 МЕ/мл).
< 7,5*102 копий/мл (<3,6*102 МЕ/мл) – ДНК вируса гепатита В обнаружена в концентрации ниже линейного диапазона концентраций.
< 105 копий/мл (2*104 МЕ/мл) – умеренная виремия (решение о терапии зависит от биохимических показателей функции печени, результатов биопсии печени).
> 105 копий/мл (2*104 МЕ/мл) – высокая вирусная нагрузка, активный инфекционный процесс (необходимо проведение противовирусной терапии).
> 1,0*108 копий/мл (>4,8*107 МЕ/мл) – ДНК вируса гепатита В обнаружена в концентрации выше линейного диапазона концентраций.
Существует зависимость между исходом острого вирусного гепатита В и концентрацией ДНК ВГВ в крови больного. При низком уровне виремии процесс хронизации инфекции близок к нулю, при средней – хронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии острый вирусный гепатит В чаще всего переходит в хронический.
Показаниями для лечения хронического ВГВ интерфероном-альфа следует считать наличие маркеров активной репликации вируса (выявление HBsAg, HBeAg и ДНК ВГВ в сыворотке крови в течение предшествующих 6 месяцев.).
