Титр бактериофага - это количество активных фаговых частиц в единице объема исследуемого материала. Для определения титра бактериофага наиболее широко в практике работы с бактериофагами применяется метод агаровых слоев, предложенный А. Грациа (A. Gratia) в 1936 г. Этот метод отличается простотой выполнения и точностью получаемых результатов и с успехом используется также и для выделения бактериофагов.
Сущность метода состоит в том, что суспензию бактериофага смешивают с культурой чувствительных бактерий, вносят в агар низкой концентрации («мягкий агар») и наслаивают на поверхность ранее подготовленного 1,5% питательного агара в чашке Петри. В качестве верхнего слоя в классическом методе Грация использовался водный («голодный») 0,6% агар. В настоящее время для этих целей чаще всего применяют 0,7% питательный агар. При инкубации в течение 6 - 18 ч бактерии размножаются внутри верхнего «мягкого» слоя агара в виде множества колоний, получая питание из нижнего слоя 1,5% питательного агара, который применяется в качестве подложки. Низкая концентрация агара в верхнем слое создает пониженную вязкость, что способствует хорошей диффузии фаговых частиц и инфицированию ими бактериальных клеток. Инфицированные бактерии подвергаются лизису, в результате чего появляется потомство фага, которое вновь заражает находящиеся в непосредственной близости с ними бактерии. Образование негативной колонии для фагов Т-группы вызвано только одной частицей бактериофага и, следовательно, число негативных колоний служит количественным показателем содержания бляшкообразующих единиц в исследуемом образце.
Культура чувствительных к фагу бактерий используется в логарифмической фазе роста в минимальном количестве, обеспечивающем получение сплошного газона бактерий. Соотношение числа фаговых частиц к числу бактериальных клеток (множественность инфекции) для каждой системы фаг-бактерия подбирается экспериментально с таким расчетом, чтобы на одной чашке образовывалось 50 - 100 негативных колоний.
Для титрования бактериофага может быть использован также однослойный метод, который состоит в том, что на поверхность чашки с питательным агаром вносят суспензию бактерий и суспензию бактериофага и смесь распределяют стеклянным шпателем. Однако этот метод уступает в точности методу агаровых слоев и поэтому не нашел широкого применения.
Техника титрования и культивирования бактериофагов.
Для определения титра бактериофага производят последовательное десятикратное разведение исходной фаговой суспензии в буферном растворе. Для каждого разведения используют отдельную пипетку, а смесь интенсивно перемешивают. Из суспензии каждого разведения делают "высев" фага на газон чувствительных бактерий E. coli. Для этого 1 мл разведенного фага вносят в пробирку с 3 мл расплавленного и охлажденного до 48 - 50 °С «мягкого агара». Затем в каждую пробирку добавляют 0,1 мл культуры чувствительного микроорганизма (E. coli В), находящегося в логарифмической фазе роста. Содержимое пробирки перемешивают, вращая пробирку между ладонями, избегая образования пузырей, и быстро выливают на поверхность агаризованной (1,5 %) питательной среды в чашке Петри и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку. При титровании методом агаровых слоев следует засевать параллельно не менее двух чашек одного и того же разведения фага. После застывания верхнего слоя чашки переворачивают крышками вниз и помещают в термостат при температуре, оптимальной для развития чувствительных бактерий. Учет результатов производят через 18 - 20 часов инкубирования.
Количество негативных колоний подсчитывают аналогично подсчету
колоний бактерий, а титр фага определяют по формуле:
N = n × D/ V, где
N – количество фаговых частиц в 1 мл исследуемого материала,
n – среднее количество негативных колоний на чашку,
D – номер разведения,
V – объем высеваемой пробы, мл.
В том случае, если необходимо определить множественность инфекции параллельно проводят определение титра жизнеспособных клеток бактерий E. coli B в 1 мл питательного бульона. Для этого делают разведение исходной суспензии бактериальных клеток до 10-6 и производят ее высев (0,1 мл) параллельно на 2 чашки. После инкубирования при 37 оС в течение 24 ч подсчитывают количество образовавшихся колоний на чашке Петри и определяют титр клеток.
Очень важным свойством бактериофагов является их специфичность: бактериофаги, как правило, лизируют бактерии определенного вида. В зависимости от специфичности различают моновалентные фаги, лизирующие культуры бактерий определенного вида, типовые фаги, лизирующие отдельные штаммы внутри вида, и поливалентные фаги, способные вызывать лизис группы родственных видов микроорганизмов
Основные методические приемы при выявлении бактериофагов, определении их активности и подсчете фаговых частиц основаны на способности фагов вызывать лизис бактериальных клеток при выращивании в жидких или твердых питательных средах. Бактериофаг, добавленный к суспензии бактерий, после заражения и образования потомства приводит к просветлению бактериальной культуры, либо, в случае полного лизиса клеток, среда становится совершенно прозрачной.
В некоторых случаях после отмеченного лизиса культуры может наблюдаться вторичный ее рост за счет размножения имеющихся в популяции фагорезистентных клеток. Размножение бактериофага и соответственно лизис клеток чувствительной культуры на поверхности агаризованной питательной среды проявляется в том, что в месте нанесения суспензии фага рост бактерий отсутствует.
Лизис культуры за счет развития бактериофага на бактериальном газоне приводит к образованию округлых прозрачных участков, называемых стерильными пятнами, фаговыми бляшками или негативными колониями фага, которые хорошо заметны при просмотре чашек в проходящем свете. Размер и форма негативных колоний являются важной характеристикой фага, например, у дизентерийных бактериофагов негативные колонии имеют звездчатую форму. Однако морфология негативных колоний может варьировать в зависимости от условий культивирования (плотности и состава среды, температуры культивирования и др.), поэтому изучение и описание данного свойства проводят в строго стандартных условиях.
По величине негативные колонии подразделяются на крупные, средние, мелкие и точечные. Диаметр образующихся колоний пропорционален скорости репродукции фага, скорости освобождения фаговых частиц из клеток и их адсорбции на поверхности неинфицированных бактериальных клеток и может быть пропорционален размеру фаговых частиц, который определяет скорость их диффузии в агаре. Следовательно, крупные фагиобразуют мелкие негативные колонии, фаги с небольшим размером вирусной частицы – крупные негативные колонии.
Морфология негативной колонии относится к признакам, чрезвычайно специфичным для данного фага, иногда для группы родственных фагов. Фаговые бляшки могут быть прозрачными или выглядеть мутными. Мутные бляшки обычно образуют умеренные бактериофаги, поскольку большинство бактериальных клеток внутри бляшки остаются лизогенными. Стерильное пятно может быть окружено одной или несколькими зонами неполного лизиса, имеющими вид окружностей различной ширины. Иногда негативные колонии опалесцируют, что обусловлено рассеянием света большим количеством фаговых частиц в негативной колонии. Сформировавшаяся негативная колония содержит 106 - 109 фаговых частиц.
Лизис бактерий может быть вызван не только бактериофагами, но также клетками крошечных бактерий (0,25 мкм), названных бделловибрионами (Bdellovibrio). Они обладают способностью прикрепляться к клеткам различных грамотрицательных бактерий, проникать через клеточную стенку, размножаться в периплазматическом пространстве и затем лизировать клетку хозяина. Метод выявления бделловибрионов предполагает использование чувствительной культуры бактерий (Enterobacter aerogenes, Pseudomonas fluorescens и др.). В отличие от бактериофагов негативные колонии, образуемые бделловибрионами, появляются не через 24 ч (как в случае бактериофагов, когда лизис бактериальных клеток начинается уже через 30 мин после инфицирования),
а не ранее, чем через несколько суток. Кроме того, бделловибрионы могут размножаться в неделящихся бактериальных клетках, и поэтому образуемые ими зоны лизиса продолжают увеличиваться в размере в течение нескольких суток. Негативные колонии, образуемые бактериофагами, прекращают увеличиваться в размере через сутки, поскольку фаги способны репродуцироваться только в активно делящихся клетках бактерий.
Размножение бактериофага в популяции бактерий представляет со-
бой совокупность множества отдельных идентичных друг другу инфекционных процессов в изолированных бактериальных клетках.
Взаимодействие каждой частицы фага с бактериальной клеткой характеризуется определенной протяженностью внутриклеточного периода развития, так называемого латентного периода.
Латентный период – это минимальный промежуток времени с момента адсорбции фага до лизиса клетки. Первая половина латентного периода, во время которой еще не удается обнаружить в зараженной клетке инфекционный фаг, называется скрытым периодом. Каждая система фаг – бактерия в стандартных условиях проведения опыта характеризуется определенными величинами латентного и скрытого периодов.
Второй важной характеристикой взаимодействия фага с клеткой бактерии является выход (урожай) фага – среднее количество частиц бактериофага, освобождаемых клеткой в момент лизиса. Можно также расчитать средний выход фага – отношение общего количества бляшкообразующих единиц (БОЕ) фага к числу первоначально зараженных бактерий.
Вышеперечисленные характеристики, присущие системе фаг – бактерия, можно определить в опыте по изучению одиночного цикла раз-
вития бактериофага (ОЦР), предложенного Е. Эллисом и М. Дельбрюком в 1939 г. (Е. Ellis, М. Delbruck, 1939). Этот эксперимент является одним из классических методов для изучения вирусов бактерий.
В опыте по изучению ОЦР культуру чувствительных к данному фагу бактерий инфицируют частицами бактериофага в таком количестве, чтобы обеспечить заражение только 10 % клеток (множественность инфекции составит 0,1). Так как адсорбция частиц фага на клетках бактерий происходит в результате их случайных столкновений, то при указанном их соотношении большинство клеток будет адсорбировать только по одной фаговой частице. После непродолжительного периода (около 5 мин), в течение которого адсорбируется основное количество частиц бактериофага, весь неадсорбировавшийся фаг нейтрализуют антифаговой сывороткой. Для того чтобы полностью исключить адсорбцию фага на бактериальных клетках дополнительно разводят инфицированную культуру для уменьшения концентрации фаговых частиц и клеток бактерий и сведения скорости адсорбции до минимума. После этого через определенные промежутки времени в течение 20 – 40 мин отбирают пробы и испытывают на наличие фага методом агаровых слоев. Подсчет числа негативных колоний на следующий день эксперимента показывает, что на чашках, засеянных инфекционной смесью, взятой на протяжении определенного периода времени после начала заражения суспензии бактерий фагом, число негативных колоний будет оставаться постоянным во всех пробах. Это время и будет представлять собой латентный период размножения бактериофага (рис). Стерильные пятна, образованные на чашках, засеянных в этот период, возникли не из свободных фаговых частиц, которые к этому времени уже были связаны антифаговой сывороткой, а явились результатом завершения одиночного цикла размножения бактериофага в зараженных клетках уже после высева пробы.
После завершения латентного периода наступает лизис клеток бактерий и в жидкую культуральную среду начинает выходить многочисленное фаговое потомство. Поэтому в пробах, взятых после завершения латентного периода и высеянных на чашки, обнаруживается внезапное увеличение количества стерильных пятен. Их количество возрастает в течение некоторого времени, иногда называемого периодом выхода фага, или периодом лизиса, до тех пор, пока все инфицированные клетки не лизируются. После этого на чашках опять обнаруживается посто-
янное количество негативных колоний, которое соответствует общему количеству фагов, освобожденных при лизисе всех зараженных клеток, и отражает установление нового (конечного) титра фага.
Бактериофаги используются:
• для идентификации микроорганизмов, в том числе и для диагностики инфекционных заболеваний (в фагодиагностике - методе косвенной диагностики инфекционных заболеваний, заключающемся в выделении специфического фага из организма больного);
• для выявления бактериального загрязнения (в фагоиндикации, когда присутствие фага рассматривают как косвенный показатель загрязненности исследуемого материала);
• для профилактики некоторых инфекционных заболеваний (в фагопрофилактике – методе предупреждения некоторых кишечных инфекционных заболеваний (бактериальной дизентерии, холеры, сальмонеллеза и др.) с помощью препаратов бактериофагов);
• для лечения некоторых инфекционных болезней (в фаготерапии – методе лечения некоторых инфекций с помощью препаратов бактериофагов).
Фагодиагностику бактерий осуществляют путем постановки пробы
на фаголизис в жидкой или плотной питательной среде. Методы фагодиагностики используют главным образом при работе с возбудителями кишечных и особо опасных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллезов, холеры, сибирской язвы, бруцеллеза).
Колифаги являются адекватными индикаторами загрязнения воды коли-бактериями, на которых они паразитируют, а также другими кишечными вирусами, поскольку и колифаги и кишечные вирусы имеют общий источник поступления в окружающую среду. Показатель наличия колифагов можно использовать для оценки эффективности процессов очистки воды от вирусного загрязнения. С 1999 г. новый СанПиН по качеству питьевой воды регламентирует ее контроль на присутствие колифагов, в случае обнаружения которых проводятся исследования воды на энтеровирусы.
В профилактических целях в бывшем СССР широко применялся сальмонеллезный бактериофаг для предотвращения распространения сальмонеллезов, а также сальмонеллезного бактерионосительства среди работников мясоперерабатывающей промышленности. Массовую фагиропрофилактику проводили при возникновении неблагоприятной эпидемической ситуации, при авариях водопроводной и канализационной сети, стихийных бедствиях, нарушающих работу коммунальных сооружений населенных пунктов. В настоящее время с профилактической целью препараты бактериофага применяются при оперативных вмешательствах в грудной и брюшной полостях, при свежеинфицированных ранах, полученных в связи с уличным или производственным травматизмом.
Препараты бактериофагов выпускают в виде таблеток, мазей, аэро-
золей, свечей и суспензий. Употребляют препараты для орошения полостей, смазывания раневых поверхностей, вводя перорально, внутривенно и т. п. Широкое применение нашли следующие лечебно-профилактические культуры бактериофагов: стафилококковый, стрептококковый, дизентерийный, брюшнотифозный, сальмонеллезный, колифаг, протейный, синегнойный; для снижения частоты бактериальных осложнений у больных используется также пиобактериофаг; имеются комбинированные препараты, используемые при кишечных инфекциях.
