(COCARBOXYLASE HYDROCHLORIDE)
3-[(4-амино-2-метил-5-пиримидил)метил]-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилтиазолио-О-дифосфоната гидрохлорид
Лиофилизированная сухая пористая масса белого цвета со слабым специфическим запахом. Гигроскопичен.
Легко растворим в воде, практически нерастворим в спирте.
BENPHOTHIAMINUM (BENPHOTHIAMINE)
N-[(4-амино-2-метил-5-пиримидил)-метил]-N-(2-гидрокси-2-меркапто-1-метил-1-бутенил)-формамидо-S-бензоат-О-фосфат или 2-метил-4-амино-5-(1’-фосфат-3’-бензоилтио-4’-метилбут-3’-ен-4’-формамидометил)-пиримидин
Белый кристаллический порошок со слабым характерным запахом.
Практически нерастворим в воде и спирте, растворим в 1% растворе гидроксида натрия.
АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ
Тиамин является двукислотным основанием.
Водные растворы (5-6%) имеют рН 2,7-3,4.
Тиамин и его производные являются очень неустойчивыми соединениями. Разрушение тиамина происходит под действием кислорода воздуха, окислителей (образование тиохрома, тиаминдисульфида), восстановителей, света (особенно УФ-лучей). Этому способствуют щелочная среда, повышение температуры. Менее устойчив при хранении тиамин хлорид, который даже в темноте постепенно разрушается, особенно во влажной атмосфере.
В растворах тиамина значение рН не должно превышать 4. За пределами оптимальной рН повышение температуры больше способствует разложению препарата, чем присутствие кислорода.
Производные термолабильны – полностью разрушаются в течение 15 минут при нагревании до 120°С.
Для стабилизации добавляют ЭДТА, цистеин.
СВЯЗЬ СТРУКТУРЫ И ДЕЙСТВИЯ
1. Замена метильной группы в пиримидиновом кольце приводит к снижению активности: замена метильной группы на пропильную приводит к образованию соединения с активностью равной 1/3 активности витамина В1; замена метильной группы на бутильную приводит к образованию соединения с антивитаминной активностью.
2. Для проявления витаминной активности необходимо наличие аминогруппы в положении 4 пиримидинового цикла. Замена аминогруппы на гидроксильную приводит к потере активности.
3. Для проявления витаминной активности необходимо наличие оксиэтильного радикала в тиазоле, атом углерода в положении 2 тиазола не должен иметь заместителей.
4. Замена метиленовой группы, связывающей пиримидиновый и тиазоловый цикл на этиленовую группу, приводит к потере активности.
5. Восстановление тиазолового цикла приводит к потере активности.
6. Замена тиазола на остаток пиридина, имидазола или оксазола приводит к образованию соединений с антивитаминной активностью.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ
1. ИК-спектр субстанции тиамина хлорида (ГФ ХII), снятый в диске с калия бромидом, в области от 4000 до 400 см-1 по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку спектра тиамина хлорида представленного в ГФ XII.
ИК-спектры фосфотиамина, кокарбоксилазы и бенфотиамина характеризуются наличием семи четких полос поглощения в области 3500-2500 см-1.
2. УФ-спектр 0,0015% раствор тиамина бромида в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты в интервале от 220 до 280 нм должен иметь максимум поглощения при 246 нм.
0,0025% водного раствора тиамина хлорида (ГФ ХII) в интервале от 220 до 350 нм должен иметь максимумы поглощения при 237 нм и 262 нм.
Водный 0,002% раствор кокарбоксилазы должен иметь максимум поглощения при 246 нм и плечо в интервале 255-268 нм.
Раствор бенфотиамина в фосфатном буфере (рН 4,9 – 5,1) должен иметь максимум поглощения при 244 нм и минимум при 225 нм.
Электронный переход от аминогруппы в пиримидиновом цикле обуславливает максимумы поглощения в диапазоне 233-236 нм.
π-π* переход в пиримидине обуславливает максимум при 265 нм.
Тиазоловый цикл – 250-255 нм
п -π* переход неподеленной пары электронов азота в пиримидине обуславливает максимум при 290 нм.
3. Тиохромная проба основана на окислении тиамина в щелочной среде:
Тиохром из водных растворов извлекают бутиловым или изоамиловым спиртом, встряхивают, дают отстояться. В верхнем слое возникает наблюдаемая в УФ-свете (365 нм) синяя флюоресценция, исчезающая при подкислении и возникающая при подщелачивании.
Тиохром образуют также фосфотиамин и кокарбоксилаза. Бенфотиамин предварительно нагревают в течение 20 минут на кипящей водяной бане.
4. Тиамина хлорид (ГФ ХII) дает характерную реакцию на хлориды: действие раствора нитрата серебра – белый творожистый осадок, растворимый в растворе аммиака:
Для подтверждения отсутствия бромид-ионов в тиамине хлориде после добавления раствора хлорамина и хлороформа в кислой среде и взбалтывания в хлороформном слое не должно быть желтого окрашивания.
5. Тиамина бромид дает реакцию на бромиды:
· действие нитратом серебра – желтоватый творожистый осадок, трудно растворимый в растворе аммиака:
· действие раствора хлорамина в кислой среде – хлороформный слой окрашивается в желто-бурый цвет:
6. Фосфотиамин дает положительную реакцию на фосфат-ион после растворения в разведенной азотной кислоте:
Бенфотиамин и кокарбоксилазу предварительно разрушают кипячением в течение 5 минут в концентрированной азотной кислоте до образования фосфат-ионов.
7. При нагревании тиамина без доступа воздуха с диметилоксолатом в присутствии тиобарбитуровой кислоты образуется красное окрашивание: на первом этапе при пиролизе тиамина вследствие наличия первичной аминогруппы происходит конденсация:
На следующем этапе выделяющийся аммиак взаимодействует с диметилоксолатом, сообразованием диамида щавелевой кислоты, который вступает в реакцию конденсации с тиобарбитуровой кислотой:
8. Под действием сернистой кислоты и ее солей происходит разрушение тиамина с образованием продуктов аналогичных расщеплению, происходящему под действием фермента тиамингидролазы.
9. Под действием слабых окислителей (раствор йода, перекись водорода) в щелочной среде происходит окисление тиамина до дисульфида, с фармакологической активностью равной активности тиамина.
10. Тиамин легко восстанавливается:
11. При действии на тиамин реактивом Несслера появляется желтое окрашивание, которое вследствие восстановления металлический ртути переходит в черное.
12. Как и другие третичные амины, тиамин при нагревании на водяной бане с уксусным ангидридом и кристаллами лимонной кислоты приобретает красное окрашивание.
13. Являясь азотистыми основаниями, дают осадки с осадительными (общеалкалоидными) реактивами:
а) с насыщенным раствором хлорида ртути (II) образуется белый осадок;
б) с 0,02М раствором йода – красно-коричневый осадок;
в) с насыщенным раствором пикриновой кислоты – желтый осадок пикрата с температурой плавления 206-208°С.
г) с реактивом Драгендорфа – оранжевый осадок.
д) с фосфорно-молибденовой кислотой – желтый осадок.
е) осаждается кремне-вольфрамовой, фосфорно-фольфрамовой, пикролоновой кислотами и др.
14. Тиамин вступает в реакцию образования азокрасителя:
15. При взаимодействии открытой тиольной формы тиамина с окисленной формой 4-аминотимола наблюдается желтое окрашивание.
16. При добавлении двух капель 15% раствора гидроксида натрия наблюдается желтое окрашивание.
17. При сплавлении с кристаллическими едкими щелочами тиамин разрушается с образованием сульфидов (за счёт ковалентно связанной серы), которые обнаруживают с помощью раствора натрия нитропруссида (красно-фиолетовое окрашивание).
18. Температура плавления: тиамина бромид 209 - 215°С (с разложением), тиамина хлорид 250°С (с разложением).
ЧИСТОТА
1. В солях тиамина проводят испытание на сульфаты (допускается не более 0,05%), определяют сульфатную золу и тяжёлые металлы. У тиамина бромида сульфатная зола из 0,5 г препарата не должна превышать 0,1% и должна выдерживать испытание на тяжёлые металлы (не более 0,001% в препарате). У тиамина хлорида сульфатная зола из 1 г препарата не должна превышать 0,1% и должна выдерживать испытание на тяжёлые металлы (не более 0,001% в препарате).
2. В фосфотиамине устанавливается наличие специфических примесей тиамина и дифосфорного эфира тиамина методом бумажной хроматографии. Используют систему: н-пропанол-вода-фосфатный буферный раствор (в соотношении 60:20:20), хроматографируют восходящим методом, сушат на воздухе, опрыскивают окислительной смесью (свежеприготовленный 2,5% раствор феррицианида калия с раствором едкого натра и 95% спирт в соотношении 1:10:20). Хроматограмму просматривают в УФ-свете при 254 нм. При наличии пятен тиамина и дифосфорного эфира тиамина интенсивность флуоресценции каждого не должна превышать интенсивность контрольного пятна тиамина. Содержание указанных примесей суммарно не должно превышать 0,5%.
3. Примесь фосфотиамина определяют в кокарбоксилазе (не более 3%) и бенфотиамине (не более 1%).
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
1. За счет основных свойств атома азота в аминогруппе и четвертичного азота в тиазоловом цикле возможно кислотно-основное титрование в среде неводного растворителя.
Для подавления диссоциации хлорид- и бромид-ионов добавляют раствор ацетата ртути (II) или в качестве растворителя используют смесь муравьиной кислоты и уксусного ангидрида 5:65 (тиамин хлорид согласно ГФ ХII).
Растворитель: ледяная уксусная кислота;
Титрант: титрованный раствор хлорной кислоты (HClO4);
Индикатор: кристаллический фиолетовый (из фиолетового до зеленого);
При титровании тиамина хлорида согласно ГФ ХII точку эквивалентности устанавливают потенциометрически со стеклянным, каломельным или хлорсеребряным электродами.
fэкв = ½.
Параллельно проводят контрольный опыт.
2. Гравиметрия.
В основе лежит реакция осаждения 10 % раствором кремне-вольфрамовой кислоты после нагревания водного раствора тиамина бромида в среде концентрированной хлористоводородной кислоты. Образовавшийся осадок кремневольфрамата тиамина (2[C12H17BrN4OS]SiO2 12WO3) отделяют, промывают на фильтре горячей разбавленной хлористоводородной кислотой, затем водой и ацетоном. Все операции выполняют на предварительно высушенной до постоянной массы воронке, которую вместе с осадком сушат при 100-105°С, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Масса осадка, умноженная на коэффициент 0,25, соответствует количеству тиамина бромида, для тиамина хлорида коэффициент 0,1929.
3. Флуориметрия по реакции образования тиохрома при длине волны 436 нм. Расчёт проводится по рабочему стандартному образцу.
4. Для гидрохлоридов, гидробромидов и фосфатов возможна алкалиметрия, которую проводят при добавлении спирто-хлороформной смеси, чтобы перевести в хлороформный слой мешающее основание.
Титрант: титрованный раствор гидроксида натрия.
Индикатор: фенолфталеин или бромтимоловый синий (тиамин хлорид и бромид);
тимолфталеин (кокарбоксилаза).
fэкв = 1 – для тиамина хлорида и бромида. fэкв =1/3 – для кокарбоксилазы.
5. По хлорид- или бромид-иону можно титровать аргентометрически:
а) Метод Фаянса.
Окисление нитратом серебра тиазолового цикла не происходит, так как титрование ведут в среде 30% уксусной кислоты.
Титрант: титрованный раствор нитрата серебра (AgNO3);
Индикатор: бромфеноловый синий (из лимонно-желтого в сине-голубой);
fэкв = ½ (для тиамина хлорида и бромида).
б) Метод Мора и метод Фольгарда не используют, так при этом происходит окисление тиазола.
в) Метод Фольгарда-Кольтгофа.
Перед титрованием добавляют точно отмеренное количество титрованного раствора роданида аммония и железоаммоиевые квасцы:
Сумму бромидов или хлоридов титруем титрованным раствором нитрата серебра:
Титруют растворм нитрата серебра полученный тиоционат железа (III):
6. Меркуриметрия (для определения гидрохлоридов и гидробромидов) в среде азотной кислоты.
Титрант: титрованный раствор нитрата ртути (II) (Hg(NO3)2);
Индикатор – дифенилкарбазид или дифенилкарбазон;
7. Спектрофотомерия возможна так как все препараты имеют максимумы поглощения в УФ-области спектра.
При определении бенфотиамина (при 244 нм) в качестве растворителя используют фосфатный буферный раствор с рН 4,95-5,05 и тот же буферный раствор с рН 6,95-7,05 для определения фосфотиамина (при 268 нм).
8. Фотоэлектроколориметрия возможна так как все препараты образуют окрашенные соединения (например, с солью Рейнеке).
На основе реакции с молибдатом аммония (в растворе серной кислоты) и аскорбиновой кислоты при 740 нм определяют содержание связанной фосфорной кислоты (20,5-23,5% в пересчете на сухое вещество) в фосфотиамине, фосфат-ионов (не более 0,6%) в кокарбоксилазе. В качестве контрольного образца используют раствор однозамещённого фосфата калия.
9. Метод Къельдаля.
10. Фотонефелометрия на основе образования кремневольфрамата тиамина.
ХРАНЕНИЕ
Тиамина хлорид, бенфотиамин, фосфотиамин – в сухом, защищенном от света месте. Тиамина хлорид и фосфотиамин гигроскопичны.
Тиамин бромид – в герметично закрытой таре, предохраняющей от действия света, без контакта с металлами.
Кокарбоксилаза – в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше +5°С. Предельный срок хранения 1 год.
ПРИМЕНЕНИЕ
Тиамина хлорид /бромид (аневрин, витамин В1) применяется при лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, при атонии кишечника, а также при заболеваниях печени. Имеются данные о положительном влиянии тиамина при дистрофии миокарда, спазмах периферических сосудов (эндартериит и др.) В дерматологической практике применяют при дерматозах неврогенного происхождения, зуде различной этиологии, пиодермии, экземе, псориазе.
Показаниями к применению тиамина являются также невриты, радикулит, невралгии, периферические параличи.
Суточная потребность составляет примерно 1 мг.
Формы выпуска: таблетки по 0,002, 0,005 и 0,01, раствор для инъекций 2,5% и 5% по 1 мл (тиамин хлорид), таблетки по 0,00258; 0,00645 и 0,0129г; раствор для инъекций 3% и 6% по 1 мл (тиамин бромид).
Фосфотиамин по сравнению с тиамином больше депонируется в тканях, в меньшей степени разрушается тиаминазой, легче переходит в активную форму кокарбоксилазу, менее токсичен. Применяют в качестве лечебного средства при невритах, полиневритах, астенических состояниях, в качестве дополнительного средства при хронической недостаточности кровообращения, при хронических гастритах, сопровождающихся двигательными и секреторными нарушениями желудка, и других заболеваниях, при которых показано применение тиамина.
Форма выпуска: таблетки по 0,01 и 0,03.
Кокарбоксилаза является коферментной формой ферментов (карбоксилаза – катализирует окислительное карбоксилирование и декарбоксилирование α-кетокислот - пировиноградной, α-кетоглутаровой), участвующих в процессах углеводного обмена. Тиамин, введенный в организм, предварительно фосфорелируется и превращается в кокарбоксилазу. Гипо- и авитаминоз витамина В1 не являются показаниями для ее назначения. Её применяют при ацидозе диабетического происхождения, печеночной и почечной недостаточности, дыхательном ацидозе при хроническом легочно-сердечном синдроме, диабетической и печеночной коме, недостаточности коронарного кровообращения, периферических невритах, различных патологических процессах, требующих улучшения углеводного обмена.
Форма выпуска: порошок в ампулах по 0,05 вместе с ампулами растворителя.
Бенфотиамин обладает В1-витаминной активностью, хорошо всасывается при приеме внутрь. Применяют при гипо- и авитаминозе В1 и других показаниях к применению тиамина, а также кокарбоксилазы (дерматозы, хронический гепатит, функциональные расстройства нервной системы и др.)
Форма выпуска: таблетки по 0,005 и 0,025.
