II принцип действия тест-системы

I Общие СВЕДЕНИЯ

1.1 Тест-система для обнаружения патогенных лептоспир методом полимеразной цепной реакции

1.2 Тест-система состоит из 3 наборов и рассчитана на проведение 50 анализов.

№	Наименование	Количество	Упаковка
Набор I - для выделения ДНК
	Раствор №1	12,0 см3	1 флакон
	Раствор №2	18,0 см3	2 флакона
	Раствор №3	12,0 см3	1 флакон
	Раствор №4	12,0 см3	1 флакон
	Сорбент	2,0 см3	1 пробирка
	Деионизованная вода	2,0 см3	1 пробирка
Набор II - для выявления ДНК патогенных лептоспир методом ПЦР
	Фермент Taq ДНК-полимераза (5ед./мкл)	0,03 см3	1 пробирка
	Положительный контроль (рекомбинантная культура лептоспир)	0,2 см3	5 пробирок
	Положительный контроль (ДНК лептоспир)	0,03 см3	1 пробирка
	Праймеры для ПЦР-1	0,27 см3	1 пробирка
	Праймеры для ПЦР-2	0,27 см3	1 пробирка
	Буфер для ПЦР-1	0,9 см3	1 пробирка
	Буфер для ПЦР-2	0,9 см3	1 пробирка
	Минеральное масло	5,0 см3	1 флакон
	Набор III - для проведения электрофореза(на 5 гелей по 10 образцов)
	Агароза	5 г	1 пакет
	50-ти кратный ТАЕ буфер для электрофореза	20,0 см3	1 флакон
	Раствор бромистого этидия (10 мг/мл)	0,15 см3	1 пробирка
	Буфер для нанесения образца	0,3 см3	1 пробирка

Тест-система предназначена для выявления 15 наиболее распространенных серогрупп Leptospira interrogans в образцах крови и мочи, в патматериале от павших или вынужденно убитых животных, в инфицированных клеточных культурах.

При точном соблюдении инструкции по применению анализ занимает от 8 до 16 часов (в зависимости от условий выделения).

1.3 Упаковка и маркировка

Компоненты тест-системы расфасовывают в полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками вместимостью 20 мл, пробирки вместимостью 0,5-2,0 мл и 5 мл. На пробирки и флаконы наклеивают этикетку с указанием краткого названия компонента.

Флаконы и пробирки каждого набора отдельно упаковывают в полиэтиленовые пакеты с указанием: организации-производителя и разработчика и/или товарного знака, наименования каждого набора, номера серии и контроля, даты изготовления и срока годности, условий хранения.

Наборы I и III упаковывают в картонные коробки. На каждую коробку наклеивают этикетку или наносят несмываемой краской следующие обозначения: страна, город, название организации-производителя и разработчика и/или товарный знак, полное название тест-системы, номер серии и контроля, дату изготовления (месяц, год), срок годности (месяц, год), предупредительную надпись «Для животных», номер государственной регистрации, знак соответствия в системе ГОСТ Р, условия хранения, количество анализов и обозначение нормативного документа. В коробку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.

1.4 Условия хранения

Хранение наборов I и III осуществляется при температуре от 2⁰С до 6⁰С, набора II – при температуре от минус 18⁰С до минус 20⁰С.

Транспортирование тест-системы проводят в теплоизолирующей упаковке (термос, пенопластовая коробка) при температуре от 2⁰С до 6⁰С. Компоненты Набора II транспортируют во льду.

Срок годности тест-системы: 12 месяцев от даты изготовления. Запрещено использовать тест-систему по окончании срока годности.

Флаконы и пробирки без этикеток, с нарушением целостности, изменением консистенции или цвета компонентов, при наличии плесени или других примесей и не использованные в течение срока годности подлежат выбраковке. Обеззараживание биоматериала и реагентов проводят, помещая одноразовую пластиковую посуду (пробирки, флаконы, наконечники) на 20- 24 ч в специальный контейнер, содержащий 0,2% раствор ДП-2Т.

 

II принцип действия тест-системы

 

2 В основе ПЦР лежит многократное повторение циклов денатурации исследуемой ДНК при температуре 94⁰С, гибридизации ДНК со специфическими праймерами при температуре 55⁰С и синтеза с них комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре 72⁰С. В результате амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле.

Для детекции лептоспир применяется двухступенчатая (т.н. «гнездовая») модификация метода ПЦР с использованием внутренних и внешних праймеров. Праймеры предназначены для определения 15 серовариантов Leptospira interrogans.

 

III Порядок применения

3.1 Подготовка к работе

3.1.1 Необходимые условия успешного проведения анализа

Строго соблюдать условия хранения и транспортировки компонентов тест-системы (см. п. 1.4).

Однократно использовать пластиковую посуду. Ранее использованные и мытые наконечники и пробирки использовать нельзя.

На всех этапах анализа в первую очередь проводить манипуляции с отрицательным контролем, затем с исследуемыми образцами и в последнюю очередь с положительным контролем.

Посуда для отбора образцов биоматериала должна быть одноразовой или тщательно обработана хромпиком, отмыта, простерилизована.

Перед открыванием пробирок капли жидкости на крышках удалять центрифугированием.

При открывании пробирок избегать случайного касания руками или инструментами внутренней поверхности крышек.

На всех стадиях обработки биоматериала удаление супернатанта производить одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи водоструйного насоса в колбу-ловушку с дезинфицирующим раствором (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т. п.).

Бромистый этидий разлагается на свету и при нагревании. Содержащие его растворы хранить в темном месте. При длительном хранении или многократном нагревании в них перед употреблением следует внести свежую порцию бромистого этидия (5 мкл на 100 мл буфера).