Состав смесей диагностических сывороток для типирования энтеровирусов

Леч. ф-т, 2006

ЗАНЯТИЕ 34

Тема №1: Лабораторная диагностика полиомиелита и заболеваний, вызываемых вирусами Коксаки, ЕСНО.

Цель: на основе знаний особенностей биологии вирусов полиомиелита, Коксаки, ЕСНО, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику лабораторной диагностики, профилактику и терапию, вызываемых ими заболеваний.

Знать:

1. Классификацию, морфобиологическую характеристику вирусов полиомиелита, Коксаки, ЕСНО.

2. Экологию, особенности эпидемиологии, патогенеза и иммунитета при полиомиелите и заболеваниях, вызываемых вирусами Коксаки, ЕСНО.

3. Материал и методы лабораторной диагностики полиомиелита и заболеваний, вызываемых вирусами Коксаки, ЕСНО.

4. Специфическую профилактику полиомиелита, неспецифическую профилактику при полиомиелите и заболеваниях, вызываемых вирусами Коксаки, ЕСНО.

Уметь:

1. Учитывать и оценивать результаты цветной пробы (ЦП), реакции нейтрализации (РН) с целью диагностики полиомиелита.

2. Учитывать и оценивать результаты РГА, РТГА с целью диагностики инфекций, вызываемых вирусами Коксаки, ЕСНО.

Контрольные вопросы:

1. Классификация, морфо-биологическая характеристика и антигенное строение вирусов полиомиелита, Коксаки, ЕСНО.

2. Программа ВОЗ по глобальной ликвидации полиомиелита; результаты ее реализации в РФ и Красноярском крае.

3. Особенности патогенеза и иммунитета при заболеваниях, вызываемых вирусами полиомиелита, Коксаки, ЕСНО.

4. Лабораторная диагностика полиомиелита и заболеваний, вызываемых вирусами Коксаки, ЕСНО: материал и методы (вирусологический, серологический).

5. Специфическая профилактика полиомиелита.

6. Неспецифическая профилактика заболеваний, вызываемых вирусами полиомиелита, Коксаки, ЕСНО.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести вирусологическое исследование с целью диагностики полиомиелита:

1.1. Учесть и оценить результаты заражения культуры ткани исследуемым материалом от обследуемого с диагнозом «полиомиелит» (микроскопически, ЦП).

1.2. Учесть и оценить результаты РН в культуре ткани методом ЦП с поливалентной и типовыми полиомиелитными сыворотками и вирусосодержащим материалом.

На основании полученных результатов сделать заключение, заполнить бланк-направление и бланк-ответ из вирусологической лаборатории.

2. Провести вирусологическое исследование с целью диагностики энтеровирусной инфекции:

2.1. Учесть и оценить результаты РГА с вирусосодержащим материалом, полученным при заражении культур ткани СМЖ обследуемого с клиническим диагнозом «Менингит. Энтеровирусная инфекция?».

2.2. Учесть и оценить результаты РТГА с поливалентной, типовыми диагностическими сыворотками Коксаки А и В, ЕСНО и полученной культурой вируса.

3. Изучить и описать биопрепараты: живая полиомиелитная вакцина, диагностические поливалентные и типовые сыворотки полиомиелитные, Коксаки, ЕСНО.

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Проведите вирусологическое исследование с целью диагностики полиомиелита:

1.1. Учтите и оцените результаты заражения культуры ткани исследуемым материалом от обследуемого с диагнозом «полиомиелит» (микроскопически, ЦП).

Материалом для вирусологической диагностики полиомиелита являются: фекалии в первые 10 дней заболевания, отделяемое носоглотки – в первые 3 дня заболевания; из СМЖ – полиовирус выделяют редко. После приготовления проб и проверки их на отсутствие бактерий заражают культуры клеток (фибробластов человеческого эмбриона или почек обезьян, HeLa и др.).

Индикацию вируса проводят по ЦПД, для полиовируса – это полная или частичная дегенерация клеток, выявляемая на 2-3 день инкубации.

Учет результатов осуществляется микроскопически или методом ЦП (см. занятие №25).

Контролем служит интактная культура клеток ткани.

1.2. Учтите и оцените результаты РН в культуре ткани методом ЦП с поливалентной и типовыми полиомиелитными сыворотками и вирусосодержащим материалом.

Идентификацию полученной культуры цитопатогенного вируса осуществляют в РН с поливалентной, а затем с типоспецифическими сыворотками I, II, III.

В качестве культуры вируса используют культуральную жидкость первично зараженной культуры ткани, которую смешивают с равным объемом диагностической сыворотки, разведенной 1:5 или 1:10, оставляют на 1-1,5 ч при комнатной t° и после этого заражают культуру ткани. Для этого в пробирку с культурой ткани вносят 0,2 мл смеси и 0,8 мл питательной среды 199.

Критерием достоверности результатов РН являются контроли:

- контроль тканевых культур (незараженная культура ткани с добавлением 1 мл среды 199) для выявления возможной неспецифической дегенерации клеток;

- контроль токсичности сыворотки (наименьшее разведение сыворотки, используемое в опыте, в объеме 0,1 мл вносят в пробирку с культурой ткани и добавляют 0,9 мл среды 199);

- контроль вируса (0,1 мл культуры вируса вносят в пробирку с культурой ткани и добавляют 0,9 мл среды 199).

Учет результатов РН осуществляется на 5-7 день. При этом следует иметь ввиду, что во флаконах с вирусом культура ткани погибает и цвет среды 199 не меняется (остается красным). Там же, где вирус нейтрализуется, среда 199 становится желтой. Положительный и достоверный результат РН свидетельствует о принадлежности вируса к соответствующему виду и типу.

На основании полученных результатов сделайте заключение, заполните бланк-направление и бланк-ответ из вирусологической лаборатории.

II. Проведите вирусологическое исследование с целью диагностики энтеровирусной инфекции:

2.1. Учтите и оцените результаты РГА с вирусосодержащим материалом, полученным при заражении культур ткани СМЖ обследуемого с клиническим диагнозом «Менингит. Энтеровирусная инфекция?».

Вирусы Коксаки А типов 1-11, 14, 16-18, 22, 24; Коксаки В типов 1-6 и ЕСНО 1-7, 9, 11-23, 25, 27, 30, 31 являются возбудителями серозного менингита, одного из распространенных заболеваний энтеровирусной этиологии. Диагноз ставится на основе использования вирусологического метода. Материалом служит СМЖ. Для индикации вирусов, обладающих способности агглютинировать эритроциты человека I(0) группы крови (Коксаки А 20, 21; Коксаки В 1-5, ЕСНО 3, 6, 7, 11-13, 15, 16, 19, 20, 25, 29), используют РГА (см. занятие №31).

2.2. Учтите и оцените результаты РТГА с диагностическими сыворотками Коксаки А и В, ЕСНО и полученной культурой вируса.

Для сероидентификации культуры гемагглютинирующего вируса используют РТГА с диагностическими сыворотками, разведенными 1:10 и культурой вируса в дозе 4 АЕ.

Для проверки достоверности результатов РТГА ставят контроли:

- контроль эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации;

- контроль сывороток на отсутствие неспецифических факторов агглютинации;

- контроль гемагглютинирующих свойств полученной культуры вируса.

Учитывая, что энтеровирусы представлены большим количеством сероваров, для их типирования используют смеси диагностических сывороток. Схема Лима и Беньшу-Мельника предусматривает применение 8 смесей сывороток для типирования 42 серотипов энтеровирусов (см. таблицу 1). Если штамм не нейтрализуется этими смесями, используют сыворотки к другим энтеровирусам. Например: выделенный вирус нейтрализуется смесями В и D и не нейтрализуется смесью F. Общими для смесей В и D являются только сыворотки к вирусам Коксаки В2 и ЕСНО 26. Учитывая, что смесь F, содержащая только сыворотку к вирусу ЕСНО 26, не оказывает нейтрализующего действия, следует, что выделенный вирус является вирусом Коксаки В2.

Таблица 1

Состав смесей диагностических сывороток для типирования энтеровирусов

Смесь	Иммунные сыворотки к вирусам
полиомиелита	Коксаки А	Коксаки В	ЕСНО
А	-		1,4	1,4,5,7,15,29,33,
В		7,9		2,3,9,19,21,26
С		-	1,3,5	2,6,12,24,29,30
D		-		6,13,14,16,25,26,32,33
E		-	4,5	5,11,13,17,18,22,30,32
F		-		7,9,14,18,19,20,26,27,29
G	-			4,5,16,17,20,23,30,31
H				1,3,9,12,22,23,32

Примечание: Цифры означают сыворотки к соответствующим серотипам энтеровирусов.