Схема постановки РНГА для определения антитоксического иммунитета

ЗАНЯТИЕ 25

Тема: Микробиологическая диагностика дифтерии.

 

Цель: На основе знаний биологии коринебактерий дифтерии, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию вызываемого ими заболевания.

 

Знать:

1. Классификацию и морфобиологические особенности возбудителя дифтерии.

2. Экологию, особенности патогенеза и иммунитета при дифтерии.

3. Материал и методы микробиологической диагностики дифтерии.

4. Методы определения антитоксического иммунитета при дифтерии.

5. Специфическую профилактику и терапию дифтерии.

Уметь:

1. Проводить забор материала из зева, носа и его посев на кровяно-теллуритовый агар с целью выявления бактерионосительства возбудителя дифтерии.

2. Идентифицировать и дифференцировать возбудителя дифтерии от дифтероидов.

3. Окрасить препарат из культуры возбудителя дифтерии по методу Нейссера, промикроскопировать и интерпретировать полученный результат.

4. Учитывать, оценивать результаты РП в геле для определения токсигенности коринебактерий дифтерии.

5. Определять уровень антитоксического иммунитета (РНГА).

 

Контрольные вопросы:

1. Классификация и морфобиологические особенности возбудителя дифтерии.

2. Фактор патогенности возбудителя дифтерии и механизм его действия.

3. Источники инфекции, пути заражения, особенности патогенеза и иммунитета при дифтерии.

4. Определение антитоксического иммунитета при дифтерии (РНГА).

5. Материал и методы микробиологической диагностики дифтерии.

6. Цель, техника постановки и оценка результатов РП в геле при диагностике дифтерии.

7. Специфическая профилактика и терапия дифтерии.

Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):

1. Провести бактериологическое исследование на дифтерию у обследуемых с клиническим диагнозом «дифтерия ротоглотки», для чего:

1.1. Изучить посевы отделяемого из зева и носа на кровяно-теллуритовом агаре, отобрать и описать характерные изолированные колонии.

1.2. Изучить характер роста и морфотинкториальные свойства культур (окраска по Граму и Нейссеру), выделенных из характерных колоний на сывороточном агаре от тех же больных.

1.3. Учесть и оценить результаты посева исследуемых культур на «пестрый ряд» (глюкоза, сахароза, крахмал, мочевина, цистин).

1.4. Учесть и оценить РП в геле исследуемых культур с антитоксической противодифтерийной сывороткой.

На основании полученных результатов определить вид выделенной культуры, ее токсигенность; заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

2. Продолжить бактериологическое исследование на бактерионосительство коринебактерий дифтерии у студентов, для чего:

2.1. Изучить посевы отделяемого из зева на кровяно-теллуритовом агаре, отобрать и описать характерные изолированные колонии.

2.2. Из отобранных колоний приготовить препараты, окрасит по Граму и Нейссеру, промикроскопировать.

На основании полученных результатов сформулировать вывод.

3. Поставить, учесть и оценить РНГА с сыворотками обследуемых и эритроцитарным дифтерийным антигенным диагностикумом для определения антитоксического иммунитета.

4. Охарактеризовать биопрепараты: АКДС, АДС, АДС-М, антитоксическая противодифтерийная сыворотка.

 

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Проведите бактериологическое исследование по выделению возбудителя дифтерии от больных с клиническим диагнозом «дифтерия ротоглотки»:

1 этап. Успех бактериологического исследования зависит от своевременного и правильного взятия материала. От больных с ангинами и с подозрением на дифтерию забор материала необходимо проводить в течение 3-4 часов с момента обращения в ЛПУ до начала какой-либо терапии.

Материалом служит слизь и пленки с миндалин из зева и носа. Взятие материала должны производить специально обученные медицинские работники.

Материал забирают стерильными ватными сухими тампонами отдельно для зева и носа. Материал из зева забирают натощак или не ранее, чем через 2 часа после еды; при хорошем освещении с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка, слизистых щек и зубов. При наличии налетов материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют один тампон, который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи.

Посев от одного обследуемого производят на одну чашку с кровяно-теллуритовым агаром (КТА), используя при этом одну половину для посева материала из зева, вторую - для посева материала из носа.

При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампоном на участке площадью 2х1 см², а затем этим же тампоном, не меняя положения, производят посев отрывными линиями. Чашки инкубируют при температуре 37°С 24-48 ч.

Посев следует производить на чашки с КТА, согретые при комнатной температуре или в термостате в течение 15-20 мин.

На 2 этапе оцените результаты посева исследуемого материала из зева и носа тех же больных на КТА. Дайте характеристику выросшим колониям, отберите и опишите в протоколе те колонии, характеристика которых совпадает с таковой предполагаемого возбудителя. Сформулируйте ответ.

 

На КТА C. diphtheriae v. gravis образуют серовато-черные колонии диаметром 2-3 мм, плоские, с радиальной исчерченностью (R-форма); C. diphtheriae v. mitis — черные, матовые, диаметром 1-2 мм, выпуклые, с ровными краями (S-форма). В препаратах коринебактерии дифтерии - это грамположительные полиморфные, прямые и слегка изогнутые палочки, расположенные под углом или в виде растопыренных пальцев, а также образуют скопления, напоминающие войлок. При окраске по Нейссеру выявляются темно-синие зерна волютина, расположенные на концах клеток. Дифтероиды, в основном, располагаются «частоколом» и обычно лишены зерен волютина.

Характерные колонии отсевают на скошенный сывороточный агар, среду Пизу и ставят РП на токсигенность. Посевы помещают в термостат при 37°С на 18-24 часа.

На 3 этапе учтите результаты РП в геле и пробы Пизу. В случае положительной РП и пробы Пизу на цистиназу, выдают ответ лечащему врачу, что выделена токсигенная дифтерийная культура.

Изучите рост культуры, отсеянной из колоний предполагаемого возбудителя, на скошенном сывороточном агаре. Приготовьте фиксированный препарат из исследуемой культуры, окрасьте по Нейссеру (уксусно-кислая синька Нейссера — 60 с, смыть; раствор Люголя – 30 с, слить; хризоидин — 10-15 с, смыть; высушить) и промикроскопируйте. Полученные результаты внесите в протокол.

Выделенную чистую культуру засевают на среды Гисса с глюкозой, сахарозой, крахмалом, цистином (проба Пизу) и мочевиной (проба Закса), а также ставят снова РП.

На 4 этапе учтите и оцените результаты работы на 3 этапе исследования:

- биохимическую активность выделенной культуры на средах Гисса, среде Пизу (цистиназа) и среде Закса (уреаза);

- РП в агаровом геле, обратив внимание на достоверность полученных результатов.

По результатам всех этапов исследования установите вид возбудителя, его биовар; определите его токсигенность и заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

 

II. Продолжите бактериологическое исследование на бактерионосительство коринебактерий дифтерии у студентов, для чего:

 

Изучите посевы отделяемого из зева и носа на кровяно-теллуритовом агаре, отберите и опишите характерные изолированные колонии.

Из отобранных колоний приготовьте препараты, окрасьте по Граму и Нейссеру, промикроскопируйте.

На основании полученных результатов сформулируйте вывод.

 

III. Поставьте, учтите и оцените РНГА с сыворотками обследуемых и эритроцитарным дифтерийным антигенным диагностикумом для определения антитоксического иммунитета.

Определение уровня антитоксического иммунитета осуществляется для оценки эффективности и качества проведения прививочной работы. С этой целью обследуется индикаторная группа населения, включающая в себя лиц, имеющих документально подтвержденных прививочный анамнез и получивших последнюю прививку за 6-18 мес. до обследования.

Для этой цели ставится РНГА в полистироловых планшетах (см. таблицу №1).

 

Таблица 1

Схема постановки РНГА для определения антитоксического иммунитета

 

Ингредиенты (капли)	Разведения исследуемого материала	КЭ	КД
1:10	1:20	1:40	1:80	1:160
Физ. раствор (1-я пипетка)	-
Сыворотка обследуемого 1:5 (1-я пипетка)			-	-	-	-	-
3% взвесь эритроцитов (2-я пипетка)							-

 

Экспозиция 30-40 мин при комнатной температуре

В дез. р-р

 

Планшеты оставляют на ровной поверхности при Т-20°С; их перемещение до учета результатов реакции не допустимо!

Учет результатов РНГА осуществляется визуально в крестах по степени агглютинации эритроцитов (см. занятие №10). В контролях должен отсутствовать феномен гемагглютинации. Титром сыворотки является последнее разведение, дающее реакцию гемагглютинации не менее ++. Для оценки результатов используют защитный титр, равный 1:20.

IV. Ознакомьтесь и опишите в протоколе биопрепараты, указав, что они содержат, для чего и как применяются.