Леч., пед. ф-ты, 2006
ЗАНЯТИЕ 24
Тема: Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных анаэробными возбудителями (клостридии газовой гангрены, столбняка, ботулизма, бактероиды).
Цель: На основе знаний биологии спорообразующих и неспорообразующих анаэробных бактерий, особенностей их взаимодействия с макроорганизмом, уметь обосновать тактику микробиологической диагностики, профилактику и терапию, вызываемых ими заболеваний.
Знать:
1. Особенности биологии спорообразующих и неспорообразующих анаэробных бактерий, определяющие их роль в инфекционной патологии человека.
2. Экологию спорообразующих и неспорообразующих анаэробных бактерий, особенности эпидемиологии, патогенеза и иммунитета, вызываемых ими заболеваний.
3. Материал и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых спорообразующими и неспорообразующими анаэробными бактериями.
4. Профилактику и терапию заболеваний, вызываемых спорообразующими и неспорообразующими анаэробными бактериями.
Уметь:
1. Учитывать и оценивать результаты микроскопии исследуемого материала при подозрении на инфекцию, вызванную спорообразующими и неспорообразующими анаэробными бактериями.
2. Учитывать и оценивать результаты посева исследуемого материала на питательные среды с целью выделения и культивирования спорообразующих и неспорообразующих анаэробных бактерий (тиогликолевая среда, Китта-Тароцци и др.).
3. Проводить идентификацию исследуемой культуры с учетом морфотинкториальных (метод Грама), биохимических («пестрый ряд»), токсигенных (реакция нейтрализации) свойств.
Контрольные вопросы:
1. Классификация и морфобиологические свойства спорообразующих анаэробных бактерий – клостридий анаэробной газовой гангрены, столбняка, ботулизма.
2. Классификация и морфобиологические свойства неспорообразующих анаэробных бактерий – бактероиды, превотеллы, порфиромонады, фузобактерии.
3. Ведущий фактор вирулентности патогенных клостридий и метод его определения.
4. Факторы вирулентности неспорообразующих анаэробных бактерий и механизм их действия.
5. Особенности экологии, эпидемиологии и патогенеза анаэробной газовой гангрены, столбняка, ботулизма.
6. Особенности экологии, эпидемиологии и патогенеза инфекций, вызываемых неспорообразующими анаэробными бактериями.
7. Материалы и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых спорообразующими и неспорообразующими анаэробными бактериями.
8. Ускоренная микробиологическая диагностика анаэробной газовой гангрены.
9. Ускоренная и экспресс-диагностика заболеваний, вызываемых спорообразующими и неспорообразующими анаэробными бактериями.
10. Специфическая профилактика и терапия анаэробной газовой гангрены, столбняка, ботулизма.
11. Профилактика и терапия заболеваний, вызванных неспорообразующими анаэробными бактериями.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Провести микробиологическое исследование биоптата (аутоптата) из глубины раны больного с подозрением на анаэробную газовую гангрену с целью установления этиологии заболевания:
1.1. Промикроскопировать препарат из биоптата, окрашенный по Граму. Сделать заключение.
1.2. Учесть и оценить результаты посева биоптата в среду Вильсона-Блера и молоко с целью ускоренной диагностики. Сделать заключение.
1.3. Провести бактериологическое исследование по выделению предполагаемого возбудителя:
- изучить посев исследуемого материала в тиогликолевую среду (визуально, метод Грама);
- учесть и оценить результаты посева выделенной культуры на «пестрый ряд»;
- оценить результаты развернутой реакции нейтрализации (РН) на белых мышах центрифугата культуральной жидкости исследуемой культуры с противогангренозными антитоксическими сыворотками.
По результатам сформулировать окончательный ответ. Заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
2. Промикроскопировать препарат из чистой культуры, выделенной при подозрении на столбняк, окрашенный по Граму. Сделать заключение.
3. Учесть и оценить результаты развернутой РН на белых мышах центрифугата рвотных масс и промывных вод желудка обследуемого с клиническим диагнозом «пищевая токсикоинфекция. Ботулизм?»
4. Промикроскопировать препарат из биоптата флегмоны стопы, окрашенный по Граму. Сделать заключение.
5. Ознакомиться со средами, методами и приборами для создания анаэробиоза.
6. Биопрепараты: противогангренозные и противоботулинистические сыворотки диагностические и лечебно-профилактические, противостолбнячная сыворотка; АКДС, АДС, АДС-М.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
I. Проведите микробиологическое исследование биоптата (аутоптата) из глубины раны больного с подозрением на анаэробную газовую гангрену, для чего:
1.1. Промикроскопируйте препарат из биоптата, окрашенный по Граму. Сделайте заключение.
Учитывая быстрое развитие клиники газовой гангрены и зависимость исхода заболевания от своевременности и целенаправленности специфического (иммунотерапия) и неспецифического лечения, важно использовать ускоренные методы диагностики.
К числу ускоренных методов микробиологической диагностики относится микроскопическое исследование мазков-отпечатков полученных биоптатов. Клостридии – крупные (0,4-1,2х3-10 мкм) грамположительные палочки, не образующие капсулы, за исключением C. perfringens. Обнаружение характерных микроорганизмов позволяет дать ориентировочный ответ о присутствии в исследуемом биоптате C. perfringens (капсульные бациллы) или других клостридий.
1.2. Учтите результаты посева биоптата в среду Вильсона-Блера и молоко. Сделайте заключение.
Посев на среды Вильсона-Блера и молоко позволяет получить ориентировочный ответ о наличии C. perfringens – основного возбудителя анаэробной газовой гангрены уже через 2-6 ч культивирования. На среде Вильсона-Блера отмечают почернение среды, на среде с молоком образуется губкообразный сгусток, пронизанный пузырьками газа («штормовая реакция»). Остальные клостридии также изменяют среду Вильсона-Блера (почернение и образование газа у газообразователей) и молоко (пептонизируют, как C. histolyticum, или свертывают), но происходит это медленнее по сравнению с C. perfringens.
1.3. Проведите бактериологическое исследование по выделению и идентификации предполагаемого возбудителя с целью установления этиологии заболевания.
На 1 этапе, помимо вышеуказанных исследований, производят посев исследуемого материала на среду для контроля стерильности (СКС) или какую-либо среду для выделения анаэробов (анаэробный кровяной агар, среда Китта-Тароцци и т. д.).
На 2 этапе изучите и оцените результаты посева исследуемого материала на СКС визуально и на основании микроскопии препаратов, окрашенных по Граму, сделайте вывод.
На среде СКС клостридии вызывают помутнение и газообразование. При микроскопии выявляют крупные грамположительные палочки, образующие споры, превышающие диаметр клетки и занимающие субтерминальное или центральное расположение. В случае получения накопительной культуры, соответствующей характеристике клостридий, осуществляется ее посев на плотную питательную среду с целью получения изолированных колоний. Чашки инкубируют в анаэробных условиях.
На 3 этапе характерные колонии отсевают на соответствующие питательные среды для выделения и накопления чистой культуры.
На 4 этапе полученная чистая культура подлежит идентификации. Укажите в протоколе свойства и методы, позволяющие определить видовую принадлежность.
На 5 этапе учтите результаты исследований, начатые на 4 этапе по идентификации выделенной культуры предполагаемого возбудителя, для чего:
- учтите результаты посева культуры на «пестрый ряд»; для оценки результатов используйте таблицу 1;
Таблица 1
Основные свойства возбудителей газовой гангрены, столбняка, ботулизма
| В и д | Капсула | Подвижность | Лецитиназа | Ф е р м е н т а ц и я | Разжижение | Молоко | |||||
| глюкозы | мальтозы | сахарозы | лактозы | маннита | желатины | свернут. сыв-ки | |||||
| Cl. perfringens Cl. novyi (тип А) Cl. septicum Cl. histolyticum Cl. tetani Cl. botulinum | + - - - - - | - + + + + + | + + - - - + | кг кг кг ± - кг | кг кг кг - - ± | кг - - - - ± | кг - кг - - - | - - - - - - | +) + ± + +) + | - - + + - + | бурное св. (3-6 ч) медл. св. медл. св. пептониз. медл. св. или не св. пептониз. |
Примечание: +) – медленно
- учтите и оцените результаты РН на белых мышах с центрифугатом культуральной жидкости и противогангренозными антитоксическими сыворотками (таблицы 2, 3).
Таблица 2
| №№ | Введено животным | Результат | |
| культуральная жидкость | антитоксическая сыворотка | ||
| 1. | + | противоперфрингенс | Мыши живы |
| 2. | + | противонови | Мыши пали |
| 3. | + | противосептикум | Мыши пали |
| 4. | + | противогистолитикум | Мыши пали |
| 5. | + | противосорделлии | Мыши пали |
| 6. | + | -- | Мыши пали |
Таблица 3
| №№ | Введено животным | Результат | |
| культуральная жидкость | антитоксическая сыворотка | ||
| 1. | + | противоперфрингенс | Мыши пали |
| 2. | + | противонови | Мыши пали |
| 3. | + | противосептикум | Мыши пали |
| 4. | + | противогистолитикум | Мыши живы |
| 5. | + | противосорделлии | Мыши пали |
| 6. | + | -- | Мыши пали |
Для определения токсигенности культуры путем постановки РН смесь центрифугата исследуемой культуры с антитоксическими сыворотками вводят подкожно белым мышам. В случае нейтрализации токсина животные остаются живыми; при отрицательной РН – животные погибают.
На основании полученных результатов определите видовую принадлежность выделенной культуры, занесите результаты в протокол, заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
