Диализованные белковые растворы размораживают, в случае наличия возможного осадка центрифугируют при 12 000 мин-1 в течение 10 мин и после предварительного разбавления определяют в них концентрацию белка одним из описанных в разделе 3.3 методов, а также активность алкогольдегидрогеназы.
В спектрофотометрическую кювету (l = 1 см) помещают реакционную смесь, содержащую:
· 0,3 мл 60 мМ Na-пирофосфатного буферного раствора (рН 8,5);
· 2,5 мл дистиллированной воды;
· 0,1 мл 15 мМ раствора НАД (рН 6,0);
· 0,1 мл 3 М раствора этанола.
Реакцию запускают добавлением 0,05 мл раствора АДГ. Общий объем пробы составляет 3 мл. Содержимое кюветы перемешивают и измеряют увеличение экстинкции раствора при 340 нм в течение 45−60 с на спектрофотометре Specord M-40 с помощью специальной кинетической программы. С помощью программного обеспечения прибора проводится расчет величины начальной скорости реакции – тангенса угла наклона касательной к кинетической кривой в нулевой точке (изменение экстинкции в секунду E/S).
Каждое определение проводят 3 раза и за результат измерения принимают среднее арифметическое значение E/S.
Величину удельной активности АДГ вычисляют по формуле
(4.9)
где А – удельная активность АДГ, мкмоль/(мин · мг белка); E/S – изменение экстинкции в единицу времени, с-1; 60 – количество секунд в 1 мин; V 1 – объем инкубационной смеси, мл; С – концентрация белка, мг/мл; V 2 – объем внесенного раствора АДГ, мл; e − коэффициент молярной экстинкции НАДН · Н+, М-1 · см-1; l – толщина кюветы, см; 103 – количество миллилитров в 1 л; 578,8 – коэффициент пересчета, учитывающий известные величины.
Сравнивают величины удельной активности АДГ, выделенной из клеток дрожжей, подвергшихся и не подвергшихся действию сульфата меди (при условии одинаковой концентрации белка), и делают вывод о влиянии ионов Cu2+ на активность фермента.
Лабораторная работа № 2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТАХ
Цель работы – освоение методов выделения пероксидазы из растительного материала и определения ее активности.
Реактивы, материалы и оборудование: стебли льна-долгунца в фазе быстрого роста; иглица хвойных деревьев; оксид алюминия; 0,02 М трис-ацетатный буферный раствор (рН 7,0), содержащий 2 мМ ЭДТА, 0,1 мМ PMSF, 2 мМ дитиотреитола; 1,66 М раствор Н2О2; 1%-ные спиртовые растворы о -дианизидина, гваякола и кониферилового спирта; жидкий азот; шпатели; ступки; стеклянные палочки; центрифужные пробирки; пипетки на 1, 2, 5, 10 мл; автоматические пипетки на 200 и 1000 мкл; химически чистые пробирки; эппендорфовские пробирки на 1 мл; кюветы для спектрофотометра; штативы для пробирок; электронные весы; рН-метр; центрифуга; спектрофотометр.
Выполнение работы
Выделение из растительного материала фракций,
Обогащенных пероксидазой
Навеску растительного материала (стебли льна-долгунца в фазе быстрого роста, иглица хвойных деревьев) ~1-3 г измельчают, помещают в фарфоровую ступку и охлаждают жидким азотом. Замороженный материал растирают в порошок и добавляют 0,02 М трис-ацетатный буферный раствор (рН 7,0) из расчета 5 мл на 1 г растительного материала. Экстракцию проводят в течение 30 мин при температуре 4°С и периодическом перемешивании.
Гомогенат количественно переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 12 000 мин-1 на протяжении 10 мин. Супернатант разливают в эппендорфовские пробирки объемом 1 мл и замораживают.
