реакції зв‘язування компелменту

Заняття №14

Тема: Серологічні реакції: реакція зв‘язування комплементу (РЗК), реакції з використанням мічених антитіл та антигенів – ІФА, РІФ, РІА

Актуальність теми: серологічні реакції використовуються в сучасній медичній практиці для діагностики інфекційних і інших захворювань, а також для оцінки ефективності лікування та профілактики.

Мета загальна: Знати цілі з якими проводяться серологічні реакції в медичній практиці та уміти оцінювати результати їх.

Конкретні цілі Вихідний рівень

Уміти:

1.Уміти поставити РЗК та оцінити її результати.	1. Готувати різні розведення досліджуваної сироватки крові.
2. Уміти оцінити результати реакцій: ІФА, РІФ, РІА	2. Визначити титр антитіл в досліджуваній сироватці (кафедра мікробіології)

Теоретичні питання:

1. Приципи та цілі проведення серологічних реакцій в медичній практиці.

2. Реакція зв‘язування комплементу (РЗК): цілі постановки, компоненти, механізми.

3. Компоненти для проведення РЗК: антитіла, антиген, комплемент, гемолітична система (гемолітична сироватка, еритроцити барана).

4. Реакції з використанням мічених антитіл або антигенів.

5. Реакція імунофлюоресценції (РІФ): різновиди, мета постановки, компоненти, механізм.

6. Реакція імуноферментного аналізу (ІФА): цілі постановки, компоненти, механізм.

7. Радіоімунний аналіз (РІА): мета проведення, компоненти, механізм.

При підготовці до заняття користуйтеся літературою:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник/ под редакцией А.А.Воробьева.- М.: МИА, 2004. – С. 283-293.

2. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія – Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. – С. 125 – 126, 141 – 151.

3. Пояснення до самостійної роботи (додаток 1).

4. Графи логічної структури (додаток 2).

ПРАКТИЧНА РОБОТА СТУДЕНТІВ

1. Поставити основну реакцію зв‘язування комплементу (РЗК) з метою серологічної діагностики кашлюку.

2. Записати в протокол поставлену РЗК, провести облік її результату і написати висновок.

3. Вивчити і записати у протокол демонстрацію з висновками.

Алгоритм практичної роботи

Таблиця

Схема постановки основного досліду

реакції зв‘язування компелменту

Номер пробірки	Інгридієнти	Наявність гемолізу
Дослідна сироватка хворого в розведенні 1/5	Антиген (в робочій дозі)	Комплемент (в робочій дозі)	Фізіологічний розчин		Гемолітична система
(дослідна) (контроль сироватки) 3 (контроль антигену)	0,5 0,5 -	0,5 - 0,5	0,5 0,5 0,5	- 0,5 0,5	Термостат: температура 37⁰С, час 40 хвилин	1,0 1,0 1,0	Термостат: температура 37⁰С, час 40 хвилин

Робота 1.2 Основний дослід РЗК. Реакцію ставите в 3-х пробірках (табл.). Відтитровані інгридієнти (антиген, комплемент, гемолітична сироватка) розвели фізрозчином таким чином, щоб робоча доза їх містилась в 0,5 мл. Одночасно готують 3%-ну суспензію овечих еритроцитів. У підсобному ряді пробірок розвели інактивовану прогріванням (56⁰С – 30 хвилин) досліджувану сироватку. При постановці реакції спочатку змішуєте досліджувану сироватку, антиген і комплемент. Суміш витримуйте при температурі 37⁰С протягом 40 хвилин. Після зазначеного терміну в пробірку додайте сенсибілізовану гемолітичну систему (2 мл гемолітичної сироватки + 2 мл 3% суспензії еритроцитів). Пробірки знов стряхніть, помістіть у термостат при 37⁰С. Реакцію визначають після того як відбудеться повний гемоліз в пробірках з контролем сироватки і контролем антигену.

Результати реакції визначають по наявності чи відсутності гемолізу у дослідній пробірці (див. табл.). Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безкольорова і еритроцити осідають на дно, негативною – при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інфтенсивно забарвлена („лакова кров”). Ступінь затримки гемолізу оцінюють в залежності від інтенсивності забарвлення рідини і розміру осаду еритроцитів на дні (++++, +++, ++, +).

Реакція зв'язування комплементу (РЗК).

РЗК відноситься до непрямих двохсистемних реакцій, яка як і інші серологічні реакції використовуються з метою серологічної діагностики (визначення в крові специфічних комплементзв‘язуючих антитіл) з допомогою відомого антигену або визначення антигенів за допомогою відомих антитіл. Як і в інших серологічних реакціях в РЗК відбувається взаємодія антитіла і антигена, але в ній ще бере участь комплемент, який зв‘язується з антитілами (IgM, IgG), які зв‘язалися з антигеном.

Розберемо випадок, коли РЗК ставиться з метою серологічної діагностики інфекційного захворювання. До досліджуваної сироватки крові хворого додаються звісний антиген і комплемент. Якщо в цій сироватці є специфічні до даного антигену антитіла, то утворюється комплекс антиген+антитіло, який приєднує до себе комплемент. Але цей процес є непомітним візуально. Це була перша система в РЗК. Для того щоб визначити в якому стані знаходиться доданий комплемент (зв‘язаний чи не зв‘язаний), додається друга система, яка називається гемолітичною. Гемолітична система готується перед постановкою реакції і складається з гемолітичної сироватки, яка містить антитіла проти овечих еритроцитів (гемолізини) і еритроцити барана (ЕБ). Імунна реакція гемолізу в цій системі відбувається при наявності незв‘язаного в першій системі комплементу.

Досліджувана сироватка хворого перед постановкою реакції прогрівається при 56⁰С – 30 хвилин для інактивації власного комплементу, який в ній знаходиться. В якості комплементу в РЗК використовується сироватка морської (гвінейської) свинки. Усі компоненти РЗК, за винятком досліджуваної сироватки, попередньо титруються і використовуються в робочій дозі.

В тому випадку, коли в досліджуваній сироватці є специфічні антитіла, утворюється комплекс антиген+антитіло, який через Fc-фрагмент антитіла зв‘язав комплемент, але це візуально не помітно. Тому додається до цієї суміші гемолітична система і якщо комплемент зв‘язаний в першій системі, то гемоліз в другій системі не відбувається, реакція позитивна - ЕБ знаходяться в осаді. В тому випадку, коли в досліджуваній сироватці антитіла відсутні, комплемент залишається в першій системі не зв‘язаним, вільним, і коли додається друга (гемолітична) система відбувається гемоліз еритроцитів, що свідчить про те що РЗК негативна. РЗК використовується для діагностики сифілісу, туберкульозу, бруцельозу, кандидозу, грипу і інших захворювань.

ДЕМОНСТРАЦІЯ

1. Антигенами для використання в РЗК можуть бути білкові або полісахаридні антигени із мікроорганізмів, бактеріальні клітини, віруси, екстракти органів і тканин.

2. Комплемент представляє собою свіжу або ліофілізовану сироватку морської (гвінейської) свинки, яку розводять 1:10. Титрують комплемент в день постановки РЗК.

3. Гемолітична сироватка готується шляхом імунізації кролів овечими еритроцитами, титрується і використовується у потрібному титрі з еритроцитами барана. З еритроцитами барана готується 3% суспензія в ізотонічному розчині хлориду натрію.

Приклади тестових завдань

1. При проведенні реакції зв‘язування компелменту (РЗК) в пробірці з дослідною сироваткою хворого утворився комплекс антиген+антитіло+комплемент, який не визначається візуально. Яким чином можна виявити цей комплекс, який інгредієнт необхідно внести в пробірку?

А. Гемолітичну сироватку.

В. Антитоксичну сироватку.

С. Антибактеріальну сироватку.

Д. Фізіологічний розчин.

*Е. Гемолітичну систему.

2. Істотним недоліком мікроскопічного методу діагностики є його недостатня інформативність у зв‘язку з морфологічною подібністю багатьох видів мікроорганізмів. Яка імунологічна реакція дозволяє значно підвищити інформативність цього методу?

А. Реакція Кумбса.

В. Імуноферментний аналіз.

С. Реакція опсонізації.

*Д.Реакція імунофлюоресценції.

Е. Радіоімунний аналіз.

3. Мічені флюорохромом антитіла (сироватки) використовують з метою:

А. Серологічної діагностики захворювань.

В. Бактеріологічної діагностики, визначення ферментативної активності збудника.

*С. Виявлення збудника в матеріалі від хворого або в культурі по антигенним властивостям.

Д. Визначення морфологічних та культуральних властивостей збудника.

Е. Визначення патогенних властивостей збудника.

4. Одним із інгридієнтів в реакції зв‘язування комплемента використовується гемолітична сироватка, в якій містяться:

*А. Антитіла.

В. Антигени.

С. Комплемент.

Д. Цитокіни.

Е. Ферменти.

5. Комплемент:

*А. Складна система сироваткових білків.

*В. Присутній в сироватці крові незалежно від імунної відповіді.

С. Синтезується в результаті імунної реакції на антиген.

Д. Приймає участь в реакції аглютинації.

Е. Отримують шляхом електрофорезу сироватки крові.

6. Функція еритроцитів в РЗК:

*А. Інгридієнт гемолітичної сироватки.

*В. Мішень для гемолітичної сироватки.

С. Носій антигенів.

Д. Носій антитіл.

Е. Об‘єкт для опсонофагоцитозу.

7. Маркери (мітки) які використовують для приготування мічених антитіл:

*А. Флюорохроми.

*В. Ізотопи.

*С. Ферменти.

Д. Комплемент.

Е. Барвники.

8. Фермент, який найчастіше використовують для приготування енщиммічених антитіл:

*А. Пероксидаза.

В. ДНК-аза.

С. Рестриктаза.

Д. Трипсин.

Е. Зворотня транскриптаза.

9. Імунологічні реакції для оцінки результатів яких використовується мікроскоп:

А. Реакція аглютинації (РА).

В. Реакція преципітації.

С. Реакція нейтралізації (РН).

Д. Реакція імунофлюоресценції (ІФА).

*Е. Реакція імунофлуоресценції (РІФ).

10. Класи імуноглобулінів, які мають властивість через Fc-фрагмент зв‘язувати комплемент:

*A. IgM.

*B. IgG.

C. IgA.

D. IgD.

E. IgE.

Додаток 1

ПОЯСНЕННЯ ДО САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ З ТЕМИ:

" Серологічні реакції: реакція зв‘язування комплементу (РЗК), реакції з використанням мічених антитіл та антигенів – ІФА, РІФ, РІА."

Компоненти реакції зв'язування комплементу (РЗК) для виявлення антитіл	1. Сироватка особи, яка обстежується (пошук антитіл). 2. Антиген. 3. Комплемент. Гемолітична система: 4. Гемолітична сироватка. 5. Овечі еритроцити (3% суспензія)
Прямий метод реакції імунофлуоресценції (РІФ)	Прямий метод РІФ заснований на тому, що мікроби або антигени тканин, до яких додані імунні сироватки зі специфічними антитілами, міченими флуорохромами, починають світитися зеленим світлом в УФ-променях люмінісцентного мікроскопа. Бактерії в препараті на склі обробленому такою сироваткою, світяться по переферії клітини в вигляді облямівки зеленого кольору
Компоненти прямої імунофлуоресценції для виявлення антигенів (експрес-діагностика)	1. Матеріал який досліджується від хворого або культура мікроорганізмів. 2. Спецфічна люмінісцентна сироватка (мічені антитіла). 3. Люмінісцентний мікроскоп
Непрямий метод реакції імунофлуоресценції (РІФ)	Непрямий метод РІФ заснований на виявленні комплекса антиген-антитіло за допомогою антиглобулінової (проти антитіла) сироватки, міченої флуорохромом. Спочатку на мазок з фіксованими на склі мікроорганізмами наноситься антимікробна кроляча діагностична сироватка, яка містить немічені специфічні антитіла, щоб відбулась реакція антиген-антитіло. Такі препарати необхідно помістити в вологу камеру на 40 хвилин. Антитіла, які не зв‘язались з антигенами мікроорганізмів злегка відмиваються водою і додається на препарат антиглобулінова (антикроляча) сироватка мічена флуорохромом. Знову препарат поміщається в вологу камеру, потім промивається водою і проводиться мікроскопія в люмінісцентному мікроскопі, як і при прямому методі РІФ. Якщо в досліджуваному мазку знаходяться збудники (мікроорганізми) які є специфічними до доданих немічених антитіл, то відбувається реакція антиген-антитіло (антитіла сорбуються на поверхні фіксованих мікроорганізмів). Цей утворений комплекс виявляється за допомогою мічених флуорохромом антикролячих антитіл, які сорбуються на повехні першого комплексу антиген-антитіло. Комплекс антиген-антитіло-антиглобулін, що утворився, легко виявляється у люмінісцентному мікроскопі. Реакції імунофлуресценції широко використовуються в медичній прктиці особливо для прискореної, експрес-діагностики інфекційних захворювань
Компоненти реакції непрямої імунофлуоресценції для виявлення антигенів (експрес-діагностика)	1. Матеріал, який досліджується. 2. Специфічна сироватка (немічені антитіла). 3. Антиглобулінова люмінісцентна сироватка (мічені антикролячі антитіла). 4. Люмінісцентний мікроскоп
Імуноферментний метод або аналіз (ІФА)	Імуноферментний аналіз (ІФА) оснований на виявленні антигенів за допомогою відповідних (специфічних) їм антитіл кон‘югованих (з‘єднаних) з ферментом-міткою (пероксидазою хрону або лужною фосфатазою). Після з‘єднання антигена з міченою сироваткою в суміш додається субстрат (хромоген), наприклад Н₂О₂. Субстрат розщеплюється ферментом і змінюється забарвлення реагуючої суміші, яке по інтенсивності прямо пропорційне кількості молекул антигена і антитіл, які прийняли участь в реакції, тобто прореагували. Твердофазний ІФА-найбільш розповсюджений варіант імунологічного методу, коли один із компонентів імунної реакції (антиген або антитіла) сорбований на твердому носії, наприклад, в лунках планшету із полістеролу. При визначенні антитіл в лунки планшеток з сорбованим антигеном послідовно добавляється сироватка крові хворого, антиглобулінова сироватка, мічена ферментом і субстрат (хромоген) для фермента. Кожний раз після додаввання слідуючого компоненту із лунок видалаяються незв‘язані реагенти шляхом ретельного промивання. При позитивному результаті змінюється колір розчину хромогену. Твердофазний носій можно сенсибілізувати не тільки антигеном, але й антитілами. В цьому випадку в лунки з сорбованими антитілами додається пошуковий антиген, додається імунна сироватка, проти антигену, мічена ферментом, а потім хромоген для ферменту
Компоненти імуноферментного аналізу для виявлення антитіл	1. Антиген на твердій фазі. 2. Сироватка крові особи, яка обстежується (пошук антитіл). 3. Антиглобулінова сироватка мічена ферментом (пероксидазою). 4. Субстрат для ферменту з індикатором на його активність (хромоген)
Радіоімунний метод або аналіз (РІА)	До радіоімунних методів відносяться методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла. Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нуклиди: тритій – ³Н і йод – ¹²⁵J. Радіоактивність заміряють за допомогою лічильника γ-проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв‘язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кільксоті. Чим більше кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв‘язується з антитілами. Принцип конкурентного РІА полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщене на твердій фазі, з‘єднують з дослідним матеріалом, в якому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв‘язуватися з антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі. Радіоімунні методи відносяться до найчутливіших імунногологічних методів, що дозволяють виявляти слідові кількості білка (нано-, пікограми). Але для їх виконання необхідні відповідні специфічні умови, які дозволяють проведення робити з радіоактивними ізотопами.

Додаток 2

Граф логічної структури до теми