Клеткаларды in vitro жағдайында өсіру

Клеткаларды in vitro жағдайында өсірген кезде олардың өсуі мен биосинтездеріне өсіретін жүйелердің техникалық көрсеткіштерінің маңызы өте зор. Өсімдіктердің қосымша заттарының биотехнология өндірісі көбнесе сұйық ортада өсетін клеткаларга негізделген. Лаборатория жағдайында қосымша метаболизмді зерттеген кезде клеткалар әдеттегідей колбаларда кішігірім көлемде (40-200мл) өсіріледі және айналмалы тербеуішілерде араластырылады. Колбалардың айналу жылдамдығы (әдетінше минутына 90-120 айналым) клеткалардың өсуіне және метаболиттердің жинақталуына әсер етеді. Мысалы, итжидек пен үйеңкі клеткаларының айналу жылдамдығы төмендегенде, олардың өсуі бәсеңдеген. Ал темекі клеткаларының өсуіне айналу жылдамдығы әсер етпеген, тіпті жылдам айналдыру арқасында оларда никотин синтезі арта түскен.

 

Агар қосылған қатты қоректік ортада өсірген клеткалар сұйық ортада өсірген клеткаларға қарағанда қосымша метаболиттерді көбірек синтездейді. Тәжірибелер көрсеткендей, борпылдақ қарқынды өсетін каллусқа қарағанда тығыз баяу өсетін каллус клеткалары алкалоидтарды артық жинақтаған, яғни әдеттегі метаболизм клеткалардың кеңістікте әлдеқандай ұйымдасуын талап етеді.

 

Қосымша заттарды алу үшін клеткалық технологияларды дайындау жұмысы төмендегідей бірнеше кезеңдерден тұрады:

 

1. Экономика жағынан тиімді өсімдікті таңдап алу. Өсіруге алынатын өсімдіктерде бағалы, экономика жағынан маңызды қосымша заттары айтарлықтай жоғары мөлшерде болуы қажет. Әсіресе, бұл жағдайдың сирек кездесетін немесе жоғалып бара жатқан өсімдіктерге қатысы бар.

 

2. In vitro жағдайына алғашқы енгізу. Ол үшін қажетті зат жоғары мөлшерде синтезделетін жеке өсімдіктер таңдап алынады. Алдымен алғашқы каллустарды қатты ортада өсіріп алады.

 

3. Биомассада қосымша заттардың сандық және сапалық құрамына химиялық зерттеу жүргізу. Бөлініп жатқан каллус клеткаларында көбінесе қосымша заттардың мөлшері бүтін өсімдіктер мүшелеріне қарағанда аз болады. Бұл тұтас өсімдікте қосымша заттардың синтезі цитодифференцировканың бақылауында болатындығын дәлелдейді. Кейбір өсімдіктерде қосымша заттардың метаболизмі өсу процесі бәсеңдегенде басталады, сондықтан оларға алдымен қарқынды өсуге, ал кейін заттардың биосинтезіне лайықты жағдай жасалады.

 

4. Үйлесімді қоректік орта мен өсіру жағдайларын іріктеу. Қосымша метаболизмді белгілейтін генетикалық информация жүзеге асу үшін ерекше жағдайлар керек. Клеткаларды сұйық ортаға көшіріп өсірген кезде, бұл жұмыс одан әрі қиындайды, себебі суспензияны өсіргенде аэрация мен араластыру факторларының әсерін де еске алу қажет.

 

5. Клеткалардың өнімді штаммдарын шығару. Барлық клеткаларда қосымша заттарды жоғары мөлшерде шығару өте қиын мақсат. Өйткені, клеткалар ұзақ уақыт өсіргенде бағалы затты синтездеу қабілетінен айырылады. Клеткалардың түріне тән ерекше заттарды синтездеу қабілетін жоғары деңгейде сақтау үшін әжептәуір күш жұмсау керек. Ол үшін генетикалық деңгейіндегі әрекеттер мен клеткалық сұрыптауды қолданады. Клеткалық технологияға негізделген тиімді ірі масштабты өндірісті ұйымдастыру үшін гормондарды қажет етпейтін (прототрофтық), қоректік ортаны талғамайтын, осмостық және механикалық стресстерге төзімді мутант клеткалары керек. Мысалы, жылан раувольфиясы клеткаларына этилениминмен әсер етіп мутагенез жүргізіп, жүрек аритмиясын емдейтін аймалин алкалоидын жоғары мөлшерде синтездейтін клеткалар линиясы алынған. Өсіру жағдайларын жақсарту нәтижесінде, осы линияда аймалин өнімділігі одан әрі өсіп, тұтас өсімдікпен салыстырғанда 10 есе артқан.

 

6. Ең жақсы өнімді штаммдарды алдымен суспензияда өсіру. Қатты ортада алғашқы шыққан каллустар сұйық ортаға көшіріледі. Өсіру тәртібі өзгергенде штамм өзінің сапасын жоғалтпауы керек, яғни ол стресс жағдайларына төзімді болу керек. Ерекше қиын кезең – клеткаларды лаборатороиялық тәжірибедегі кішкене колбалардан үлкен ферментерлерге көшіру. Қазір биотехнологиялық өндірісте клеткаларды әр түрлі факторлар (температура, газдар құрамы, жарық, қышқылдық, физиологиялық активті заттардың мөлшері) автоматтық реттелетін ферментерлерде өсіреді.

 

7. Өнімді және тұрақты штаммдарды өндіріс жағдайына жақын, көлемдері жүйелі кеңейтілетін ферментерлерде өсіру. Егер клеткалар осындай жартылай өндіріс жағдайында өсу қарқындылығын сақтап және қажетті заттың синтезін, жинақталуын және оның ортаға бөлініп шығуын өзгертпесе, бұндай штаммды ірі масштабтық өндірісте пайдалануға болады. Штаммның бұдан басқа маңызды қасиеті, оның генетикалық тұрақтылығы, өзіне тән биологиялық активтілігін сақтауы.

 

8. Клеткалық биомассаны алу және оны бағалаудың техникалық регламентін (іс тәртібін) жасау. Өндірістік технология тиісті аппаратураны талап етеді. Мысалы, Жапонияда қолданылатын көлемі 20000 л ферментерде темекі клеткалары үш ай бойынша үзіліссіз өсіріледі. Сол клеткалар күніне әрбір литрден 5,582 г убихинонды өндіреді

Қазіргі уақытта кей елдерде 100-ге жуық өсімдік түрлері маңызды қосымша заттарды алу үшін биосинтездік өндірісте қолданылады. Олардың ішінде: жень-шень, жылан раувольфиясы, жүн және қызғылт оймақгүлдері, дельта тәрізді диоскорея, торғайшөп, итжидек, бөліктенген алқа, кәдімгі сасықмеңдуана, май меруертгүлі, үпілмәлік, агава, тіс амми, апиын көкнәр, т.б.

 

Жалпы жасанды қоректік ортада өсірілген клеткаларда генетикалық информация сақталады, бірақ оның жүзеге асуы үшін ерекше жағдайлар қажет. Шамамен, жоғары өнімді өсімдіктер мен ұлпалардан бөлініп алынған клеткаларда сол метаболиттердің биосинтезіне қажет генетикалық информациясы болады.

 

Ал болашақта өнімді штаммдарды шығарудың ең тиімді жолы, ол клеткалық және гендік инженерия әдістерін пайдаланып жаңадан өте өнімді қажетті клеткаларды құрастыру болып табылады.

Биотехнологияның негізгі мақсаты - мәдени өсімдіктердің жаңа сорттарын шығаруға қажет селекциялық материалды аз уақыт ішінде алу үшін өсімдік жасушаларын өсіру.

Сімдік клеткаларын қолдан өсіру дегеніміз өсімдіктің жеке жасушаларын, ұлпаларын, мүшелерін асептикалық жағдайда жасанды қоректік ортада өсіру.

Өсімдік ұлпасының стерилденген кішкене бөлшегін Петри чашкасының немесе пробиканың ішіне агаризонды қоректік ортаға орналастырады. Содан кейін ұлпада жасушалар белсенді түрде бөліне бастайды. Жасушалық түзілім тез өсіп каллус түзеді. Каллус дегеніміз дифференцияланбаған жасушалардың жинақталып ерекше ұлпа түзуі. Егер осы каллустың бөліктерін балғын қоректік ортаға отырғызса, онда олар шектеусіз өсе алады.

«Өсімдік жасушасын қолдан өсіру» термині ауқымды және ыңғайлы ұғымға айналды, ол бөлініп алынған жасушаны, ұлпаны, мүшелерді, ұрықты және тұтас өсімдік-регенерантты қолдан өсіретін in vitro- ның барлық жұмыстарын қамтиды. In vitro термині (лат.- шыныда, әйнекте) стерильді жасанды қоршаған ортада өтетін процестердің жағдайларын сипаттау үшін қолданылады. In vivo (лат. – тіршілікте) организмнің тіршілік процестерінің табиғи стерильді емес ортада өтуі. Өсімдік-регенерант дегеніміз асептикалық түрде алынған, тамыры мен өркені мәдени ортада қалыптасқан өсімдік, демек in vitro.

Теориялық түрде кез келген өсімдік жасушасы өзін бөліп алған организмге дейін дамуға потенциалды түрде қабілетті және ол белгілі бір жағдайларда қолдан өсірілген. Бұл қасиет тотипатенттілік деп аталады. Тотипатенттілік (лат. totus – барлық, тұтас, potential – күш) – тұтас организмге дейін дамуын қамтамасыз ететін өзіне тән генетикалық ақпаратты сақтап, үйлестіретін жасушаның қасиеті. Әдетте, әмбебап тотипатенттілік қасиетке өсімдіктің және жануардың ұрықтанған жұмыртқа жасушасы ие. Ал сомалық жасушалардан тотипатенттілік қасиетке тек қана өсімдік жасушалары ғана ие, әрі ол in vitro жағдайында ғана. Қолдан өсірілетін жануарлар жасушасы тотипатенттілік қасиеттен айырылған.

XIX-XX ғасырларда алғаш рет неміс ғалымдары өсімдіктің бөлініп алынған бөліктері мен мүшелерін өсіре бастады. 1883 жылы К.Рехингер бүршіктерді, тамыр мен сабақтың телімдерін ылғалды құмда өсіруге тырысқан. Ол кейбір тәжірибелерінен каллустың түзілгенін байқаған, алайда қорекпен қамтамасыз етілмегендіктен және стерильді жағдайлар

сақталмағандықтан ұзақ өсетін өсімдіктерді ала алмаған. Мұндай тәжірибелерді Х.Фехтингте жүргізген.

1902 жылы Г.Габерланд жасушаларды қолдан өсіру принциптерін алғаш рет нақты қалыптастырды. Ол бірқатар жабық тұқымды өсімдіктердің жапырағынан бөліп алынған паренхима жасушаларымен тәжірибе істеді және қоректік орта ретінде сахароза, аспарагин, пептол қосылған Кноп ерітіндісін қолданды. Г.Габерланд өсімдіктің кез келген тірі жасушасы тотипатенттілік қасиетке ие деген гипотезаны алға тартты және жалғыз бір жасушадан ұлпа өсіруге тырысты. Бірақ ол өзінің керемет жаңалығын экспериментті түрде дәлелдей алмады, өйткені ол қолайсыз объектілерді тандаған болатын: белсенді түрде бөліну мен эмбриональды өсу қабілеттерін жоғалтқан жіңішке дифференцияланған арнайы жасушалар. Кейіннен белгілі болғандай жас ұлпалардың меристемалық және белсенді қызмет жасайтын жасушалары ғана қолдан сәтті өсіріледі.

Сонымен қатар өсімдік жасушаларын организмнен тыс өсіру жануар объектілерімен айналысушы ғалымдарды да қызықтыра бастады. Алғаш рет жануардың бөлініп алынған жасушасын өсіру мүмкін екендігі дәлелденді. 1904-1907 жж Р.Харрисон бақаның нейробластын лимфа сұйықтығында өсірді. Осыдан кейін жануарлардың жасушасын қолдан өсіру әдістері жасала бастады, қоректік орта ретінде лимфа, қан плазмасы, ұрық сұйықтығы пайдаланылды. Организмде жануарлар жасушасы қанмен және лимфамен қоректенеді, сондықтан оларды осындай қоректік ортада өсіру табиғиға ұқсас болып келеді. Ал өсімдік организмінің қоректік заттарға бай болып келетін мұндай сұйық ортасы жоқ, тіпті флоэма экссудатыда мұндай талаптарға сай келмейді.

Америкалық ғалым Ф.Скуг қызметкерлерімен бірге темекі сабағының телімінде бүршіктердің өсуін зерттеді және құрамында минералды тұздары, көмірсулары және витаминдері бар қоректік ортаға өсірді. Каллустың түзілуі, кейде бүршіктердің қалыптасуы байқалған. Қоректік ортаға ауксиннің қосылуы бүршіктердің өсуі мен қалыптасуын тежеді. Ал ортаға аденин керісінше бүршіктердің қалыптасуына әсер етті және ол ауксиннің тежеушілік әсеріне бөгет жасады. Бұл зерттеушілерді кокос сүтінің өсу факторында қандай да бір пуриндік заттар бар деген ойға әкелді. Сондықтан олар алдымен нуклеин қышқылдарын зерттеуді бастайды. Содан кейін сельд спермасының ДНҚ-сы темекі жасушаларының бөлінуіне әкелетіні анықталады. Осы нәтижені ұзақ уақыт бойы сақталған ДҚН-ның ескі препараты тапты – соған қарағанда өсу факторы ДНҚ бұзылуының өнімі болғанға ұқсайды. Ф.Скуг пен оның қызметтестері темекі сабағының паренхима клеткаларының бөлінуіне және ауксиннің қатысуымен бүршіктердің дамуына әсер ететін затты ашытқыдан бөліп алды. Бұл өсуді реттейтін затты олар кинетин деп атап, ал кинетин жататын өсуді қамтамасыз етуші класты цитокининдер (жасушаның бөлінуін қамтамасыз ететін заттар) деп атады. Осы жаңалықтың арқасында Т.Мурасиге мен Ф.Скуг

1962 жылы темекі каллусының өсуіне қажет атақты қоректік ортаның құрамын жасады. Бұл қоректік орта көптеген өсімдік түрлерінің әртүрлі ұлпалары мен мүшелерін қолдан өсіруге бірден бір лайық орта болып саналды және қазіргі уақытта осы орта кеңінен қолданылады.

Өсімдіктердің жасушаларын, ұлпаларын және мүшелерін қолдан өсіру сәтті шығу үшін жасанды ортаның құрамының жақсы болуымен қатар әртүрлі қолайлы жағдайлар жасалуы қажет. Осы айтылған сөзге жасушаны қолдан өсіру сәтті болуы үшін үнемі температура шамамен 25±2°С болуы қажет деп жалпылай қабылданған шешім дәлел болады. Алайда мұндай дәстүрлі тәсіл ақпараттың аздығынан қолданылған болатын. Өйткені темекінің каллусының өсуіне 32°С, кәдімгі гармалаға 30°С, ипомеяға 30-32°С қажет.

Температура өсімдікте жүретін метаболизм процестерінің бәріне әсер етеді. Температураны эксперименттің мақсатына байланысты әрбір объектіге жекелей лайықтыланып қойылуы керек. Бірақ мұндай тәжірибелерді жүргізу үлкен еңбек пен ұзақ уақытты талап етеді, сондықтан ғалымдар жасушаларды шамамен 25°С температурада өсіре береді.

Жасушаларды қолдан өсіруге әсер етуші сыртқы факторлардың бірі – жарық. Қазіргі уақытқа дейін фотоавтотрофтылық тек 16 өсімдіктің түріне ғана тән екені сипатталыпжазылған. Қалғандары фотоавтотрофтылық өсуге қабілетсіз, оларды қараңғыда немесе әлсіз түскен жарықта өсіреді. Хлорофилдерінен айырылған ұлпаларға жарықтың әсер етуі фитохромды жүйемен қамтамасыз етілген. Екіншілік қосылыстарды алу үшін қолдан өсірілетін жасушаны қолданатын эксперименттерде жарық пен фотопериодтың белсенділігі мен сапасының әсері нақты тағайындалған. Жасуша технологиясында жасушаларды жарықпен қамтамасыз ету басты міндеттердің бірі.

Жасушаларды сәтті өсіру үшін қажет маңызды факторлардың бірі – аэрация. Аэрациясыз ешбір жасуша тіршілік ете алмайды. Газдардың (оттегі, азот, көмірқышқыл газы) жасушаларға әсері мүлдем зерттелмеген.

Жасушаларды өсіруде және жасанды ортасын жасағанда физикалық фактор осмос қысымыныңда әсерін ескеру қажет.

 

Каллусты алу және оны қолдан өсіру.

Каллус – жасушаның қалыптаспаған пролиферациясынан пайда болған ұлпа. Пролиферация – жасушаның және ұлпаның бөлінуінен пайда болған жаңа түзілімдер. Каллус (лат. callus – тірі тері, мозоль) – өсімдікте жарақаттанудың нәтижесінде пайда болған ұлпаның ерекше түрі. Ол жараның орнын қорғайды және қоректік заттар жиналып арнайы қорғаныш қабаты түіледі немесе жараланған мүше қайтадан қалыптасады. Мұндай жасушалар ұлпалар мен жасушаларды қолдан өсіру барысында да пайда болады. in vitro каллусының түзілуі және өсуі ауксин мен цитокининмен реттеледі.

Каллусты алу және оның ары қарай өсуі стерилбдікті талап етеді. Жақсылап жуылған өсімдік материалы құрамында белсенді хлор

(кальций мен натрий гипохлориті, хлорамин, хлорлы әк), сынап (сулема, диоцид), сутегі диоксид, этанол бар әртүрлі заттармен стерилденеді. Осындай мақсатта бромды, күкірт қышқылын, фенолды және ерекше жағдайларда антибиотиктерді сирек қолданады. Стерилдеуші заттың түрі, концентрациясы әсерт ету ұзақтығы стерилдеуге дайындаған өсімдік объектісіне байланысты болады. Стерилдеуші зат барлық микроорганизмдерді жоятындай және өсімдік ұлпаларын минимальды жарақаттайтындай әсер етуі тиіс, сонда стерилдеуші зат дұрыс таңдалған болып табылады. Сонымен қатар стерилді зат сумен жуғанда кетуі тиіс, әйтпесе ұлпалардың улану қауіпі туады да эксперименттің нәтижесіне кері әсер етеді. Әдетте танымал стерилдеуші әдістерді қолданады немесе әрбір объектіге экспериментті түрде арнайы стерилдеу әдісін жасайды. Қолайлы стерилді қоректік ортаға орналастырылған эксплант деп аталатын ұлпаның немесе мүшенің фрагменті біраз уақыт өткеннен кейін өсе бастайды да каллус пайда болады. Бұл процесс каллустың түзілуі немесе каллусогенез деп аталады.

 

 

Жоспар

1.Кіріспе.

2.Негізгі бөлім.

2.1 In vitro ны зерттеу кезеңдері.

2.2 Кілеткаларды In vitro жағдайында өсіру.

2.3Калусты өсіру.

3.Қорытынды.

3.1.Пайдалынылған әдебиеттер.

 

Пайдаланылған әдебиеттер

1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотеехнология на их основе. М: ФБК-ПРЕСС, 1999.160с.

2. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. Алматы:Қонжық, 1996ж,272с.

3. Бегімқұлов Б. Молекулалық генетика және биотехнология негіздері. Алматы.Білім, 1996.200б.

4. Артамонов В.И. Биотехнология-агропромышленному комплексу. М.: Наука, 1989, 158с