Примеры репликативных векторов, используемые в метанотрофах

Конструирование путей обмена веществ

Домашняя страница журнала: www.elsevier.com/locate/ymben

Конструирование путей обмена веществ метанотрофных микроорганизмов

Marina G. Kalyuzhnaya ^a,c, Aaron W. Puri ^b, Mary E. Lidstrom ^b,c,*

^a Кафедра биологии, государственный университет Сан - Диего, Сан-Диего, CA 92182-4614, США

^b Отдел химической инженерии, Сиэтл, WA 98195, США

^c Отдел микробиологии, Университет штата Вашингтон, Сиэтл, WA 98195, США

______________

Аннотация Метан, в виде природного газа или биогаза, является наименее дорогим источником углерода для (био) химического синтеза. Масштабируемая биологическая переработка этого простого алкана для химии и в качестве топлива может принести новые устойчивые решения для ряда отраслей с большим воздействием на окружающую среду, таких как добыча природного газа/нефтепродуктов, свалки, очистка сточных вод и отходы животноводства. Микробноый биокатализ с использованием метана в качестве сырья, использовался на протяжении почти полувека, с небольшим устойчивым успехом. Сегодня, биологическая инженерия и системная биология предоставляют новые возможности для моделирования метаболического пути и дают новую оптимистичную концепцию применения метана на основе биоиндустрии. Здесь мы представляем обзор самых последних достижений, относящиеся к конструированию путей обмена веществ при помощимикробиологической утилизации метана. Некоторые идеи, касающиеся перестройки обмена веществ для производства ацетил-КоА и пирувата, как двух основных предшественников биоконверсии, представлены в обзоре. Мы также обсудим основные пробелы в знаниях об аэробной утилизации метана, которые должны быть решены для того, чтобы освободить весь потенциал метана на основе биосистем. © 2015 Международный Метаболический Engineering Society. Опубликовано Elsevier Inc. Все права защищены.

Информация о статье

__________________

История статьи:

Поступило 24 октября 2014

Поступило в переработанном виде

26 февраля 2015

Принято 17 марта 2015

Доступно в сети 28 марта 2015

_________________________

Ключевые слова:

Природный газ

Метанотрофы

Пути обмена веществ

 

 

*Автор для связи: факс +1 206 685 9210.

Адрес электронной почты: [email protected] (M.E. Lidstrom).

 

http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2015.03.010

1096-7176/ © 2015 International Metabolic Engineering Society. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.

 

Введение

1.1. Обзор метанотрофов

Для того, чтобы обеспечить контекст для понимания метаболической инженерии из разделов данного обзора, мы включаем краткое описание метанотрофов и метанотрофии. Метанотрофами являются бактерии, которые используют для роста метан в качестве единственного источника углерода и энергии. Всплеск интереса к этим бактериям происходит, отчасти из-за заинтересованности в снижении выбросов метана в атмосферу в качестве парникового газа (Shindell et al., 2012), из-за обилия и низкой стоимости природного газа, а также потенциала создания белковых продуктов с высокой стоимостью (Conrado and Gonzalez, 2014). Последние процессы могут играть важную роль в будущей энергетической устойчивости. В этом обзоре мы остановимся на тех бактерий, которые используют кислород для окисления метана.

Рис. 1 содержит обзор аэробных метанотрофов и пути их метаболизма. Читатель ссылается на веб-сайт, который содержит большое количество базовой информации о метанотрофах (http://www.methanotroph.org), под который этот обзор был адаптирован. Микробная утилизация метана, как известно, происходит в аэробных и анаэробных условиях.

Аэробные метанотрофов могут быть разделены на три основные группы: группа I (Gammaproteobacteria, также упоминается как тип I и тип Х; Anthony, 1982; Semrau et al., 2010), II группы (Alphaproteobacteria, также упоминается как тип II и тип III; Dedysh et al., 2001) и группа III (Verrucomicrobia, иногда называют IV типа (Murrell and Jetten, 2009). Это часть обзора будет в основном сосредоточены на метанотрофов I группы, из-за ряда предпочтительных метаболических способностях. Эти метанотрофы концентруруют формальдегид с помощью рибулозы монофосфата в результате продуцируется фруктозо-6-фосфат (Anthony, 1982; Semrau et al., 2010; Kalyuzhnaya et al., 2013). После того, как образовалась фруктозо-6-фосфат, она связывается с ядром "углевода" – образуя связанные метаболические пути, таких как гликолиз, окислительный и не окислительный пентозофосфатный путь и путь Энтнер-Дудорова (Trotsenko and Murrell, 2008; Kalyuzhnaya et al., 2013). Так как этот сахаро-фосфатных поток зависит от метаболического пути аналогичному тому, который в обычных условиях производят промышленные штаммы, таких как Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae, группа 1 метанотрофов может быть предусмотрена в качестве микробных катализаторов, которые могут заменить метан для сахара в качестве углеродного сырья.

Все известные аэробные метанотрофы используют метанмонооксигеназу (ММО) на начальной стадии окисления, которая превращает метан в метанол (Semrau et al., 2010; Fig. 1)

Метанол окисляется до формальдегида, который затем может быть превращен в биомассу, или далее окисляется до формиата и затем до углекислый газа. Известны два изо фермента: растворимая метанмонооксигиназа (sMMO), которая находится только в небольшом числе известных метанотрофов, и связанную с мембраной (или частицей) метанмонооксигиназу (pMMO), которая встречается практически во всех известных метанотрофах. Обе оксигиназы (sMMO и pММО) выполняют функции оксидаз, в котором один атом от O₂ идет на метанол, а другой к воде, при этом требуется задействование двух электронов и двух протонов (Semrau et al., 2010). sMMO использует НАДН, однако физиологический донор электронов к pMMO до сих пор не известен. В результате очистки pMMO результаты показывают существенную утрату активности, и, таким образом, кинетические параметры настоящего донора электронов фермента слабо изучены. Тем не менее, культуры, экспрессирующие pMMO обычно показывают более высокую сродство к метану по сравнению с клетками, экспрессирующими sMMO. Кроме того, было показано, что клетки, использующие pMMO для роста, проявляют более высокий уровень выхода, предполагая, что pMMO является более эффективной системой для окисления метана (Leak and Dalton, 1986)

 

Рис. 1. Обзор метанотрофов и их пути метаболизма. Ключевые циклы обведены синим. Список сокращений. H4F: путь тетрагидрофолат; H4MPT: путь тетрагидрометаноптерина.

Ключевые ферментывыделены синим: pMMO: мембрансвязанная метанмонооксигеназа; sMMO: растворимая метанмонооксигеназа; MeDH: метанолдегидрогеназа; hps: глюкоза 6-фосфат-синтаза; fdh: формиатдегидрогеназы; RuBisCO: Рибулозо 1,5-дифосфаткарбоксилаза; SHMT: серин гидроксиметилтрансфераза. (Для интерпретации упоминания цвета к этому рисунку, читателю следует обратиться к веб-версии этой статьи.)

 

pMMO находится в специализированных внутренних мембранных структурах, называемых ICMS (внутрицитоплазматические мембраны (Anthony, 1982; Semrau et al., 2010).

 

1.2. Нерешенные проблемы в метанотрофии.

 

Хотя метанотрофы изучались на протяжении многих десятилетий, все еще существуют основные пробелы в наших фундаментальных знаниях об этой важной микробной культуре, которые могут ослабить стратегию метаболической инженерии. Для успешного конструирования путей обмена веществ, важно понять, что не известно о метанотрофии и как эти пробелы в знаниях должны быть решены. Примерами являются отсутствие данных: мы не знаем, как идентифицировать донора электронов pMMO, составляющих обширную систему окисления метана, включая те, которые участвуют в переносе электронов и как регулируется поток углерода. В целом метаболические пути по потоку от первичного усвоения метана плохо решаются, и очень мало известно о том, как метанотрофные бактерии приспосабливаются к изменяющимся экологическим параметрам или условиям культивирования. К ним относятся использование NH⁺₄ вместо NO₃^- или S^2-вместо SO4^2- как источника азота или серы соответственно, а также недостаток кислорода и добавление при культивировании метанола, водорода или многоуглеродного органического соединения и т.д. Эти недостатки в знаниях затрудняют создание полезных метаболических моделей и прогнозировать ключевые показатели для метаболической инженерии. Подобные проблемы должны быть решены, если может быть реализован потенциал метанотрофов внести свой вклад в экономию энергии Конкретная информация о наборе нерешенных проблем представлена ниже.

 

1.2.1. Донор электронов pMMO

 

Несмотря на значительные усилия в этой области, физиологический донор электронов к pMMO до сих пор не найден (рис. 2). Поскольку различные возможные результаты приводят к значимым метаболическим различиям, особенно в отношении любого спроектированного пути, который включает в себя НАД(Ф)Н, или АТФ, и эта неопределенность должна быть решена. Без четкого понимания баланса клетки на основе НАД(Ф) H/ АТФ, прогнозирование метаболических моделей не может быть проверена и набор вероятных путей должен быть рассмотрен. С тех пор как метаболические модели первоначально основываются на инструментах обмена веществ, это отсутствие определенности является важным фактором для успешного построения пути обмена веществ. Здесь мы обобщаем имеющиеся знания, выделим наиболее вероятные варианты, которые должны быть включены в анализ метаболической системы.

Сходство между pMMO и монооксигеназной аммония (AMO; Holmes et al., 1995) побудили предположения, что эти две системы должны иметь аналогичные доноры электронов. Показано, что дигидрохинол способен управлять pMMO в пробирке (Cook and Shiemke, 2002; Choi et al., 2003; Shiemke et al., 2004), а при хранении с АМО, предполагается, что эндогенный хинол (UQH2) играет эту роль в естественных условиях (Arp et al., 2007; Simon and Klotz, 2013).

Тем не менее, источник электронов при окислении убихинона до сих пор не ясен. По аналогии с системой АМО то можно было бы ожидать, что электроны от окисления метанола могут быть восстановлены в убихиноне. Ферментом, который окисляет метанол в метанотрофах является периплазматическая PQQ-сшитая метанолдегидрогеназа (MeDH), которая соединена с цитохромом С (Anthony,2004). Был предложен обратный перенос электронов от MeDH, но он в полной мере не подтверждается экспериментальными данными (Leak and Dalton, 1986). В некоторых метанотрофах присутствет мембран-связанный мнимый ген, содержащий формальдегиддегидрогеназу, и было предложено, что он может быть источником электронов для создания убихинола (Semrau et al., 2010). Тем не менее, гены, кодирующие эту формальдегиддегидрогеназу были идентифицированы только в нескольких геномах метанотрофов, предполагая, что эти ферменты не являются ключевыми. Один из альтернативных вариантов, который был предложен, это тип 2-НАДН: хиноноксидоредуктазы (NDH-2), которая является распространенной в геноме метанотрофов (Choi et al., 2003).

Каждый из предложенных вариантов имеет различия в прогнозируемых затратах энергии и в результате дает отношение потребления О2/СН4, что должно учитываться отдельно в метаболической модели. До сих пор существующие экспериментальные данные по этим параметрам не исключают любую из этих ситуаций. Совместная локализация pMMO и MeDH и сообщения о низком соотношении O2/CH4, по всей видимости, подтверждают гипотезу о прямой связи от окисления метанола (Fassel et al., 1992; Kitmitto et al., 2005;Culpepper and Rosenzweig, 2014)

Представлены альтернативные системы для окисления формальдегида и формиата при использовании НАД(Ф)H, которые, в свою очередь, можут быть использован для создания убихинола из убихинона (Trotsenko andMurrell, 2008; Vorholt 2002). В соответствии с этой теорией, извне добавляемый формиат стимулирует скорость окисления метана и может увеличить выделение метанола (Furuto et al., 1999; Lontoh et al., 2000). С другой стороны, способность метанотрофных бактерий превращать метан в органические кислоты и Н₂ в анаэробных условиях (описано ниже), предполагает, что pMMO может использовать источник электронов, отличных от НАДН (Kalyuzhnaya et al., 2013). Таким образом, хотя существует множество гипотез о существовании физиологического донора электронов для pMMO, в настоящее время никто четко не выделяется над другими. Вполне возможно, что в зависимости от условий роста, множество источников электронов может быть приведено в действие, что подчеркивает важность рассмотрения всех этих возможностей при проектировании путей, изменяющие NAD (P) H или АТФ кластеры в клетке.

 

 

Рис. 2. Окисление метана с помощью мембрансвязанной метанмонооксигеназы (pMMO).

Локализация в клетке отображается красным цветом, а ключевые ферменты синим. Скорее всего, физиологический донор электронов к pMMO это убихинол (Q8H2). Источник электронов, чтобы превратить убихинон в убихинол пока не известен. Метанолдегидрогеназа (MeDH) физически связаны с pMMO. Высвобождение Н⁺в периплазме клетки способствует затрату энергии. (Для расшифровки упоминания цвета к этому рисунку, читателю следует обратиться к электронной версии этой статьи.)

 

1.2.2. Компоненты электронного транспорта

 

Анализ, представленный ранее, демонстрирует еще один пробел в наших знаниях, которым является состав компонентов электронного переноса в метанотрофах. Хотя предположения могут быть сделаны на основе известных компонентов электронного транспорта в последовательности генома; генетические, физиологические и биохимические исследования необходимы, чтобы определить, существуют ли новые компоненты, которые объединяют окисление одно- углеродных соединений в энергетическом обмене. Отсутствие такого экспериментального подтверждения создает еще больше неопределенности в НАД (Ф) H и АТФ баланса клетки, и делает конструирование пути обмена веществ при помощи манипулирования в цепи переноса электронов более сложной, чем у бактерий, в которых такая информация известна.

 

 

1.2.3. Превращение метана и метанола в метанотрофах,

Выход биомассы клеток значительно выше на метане, чем на метаноле (Whittenbury et al., 1970), хотя, затраченная энергия, используемая на стадии окисления метана, показывает прямо противоположный результат. Эта задача предполагает, что система окисления метана не идентифицирована, и в настоящее время только прогнозируется. Возможным объяснением может быть то, что pMMO непосредственно взаимодействует с метаноломдегидрогеназой (MeDH), и это приводит к эффективному поглощению энергии.Известно, что в метанотрофах, MeDH расположена главным образом как в полости клетки (периплазмы) ICMs, которая слабо связанными с поверхностью мембраны, так и в комплексе с pMMO (Culpepper and Rosenzweig, 2014), (рис. 2). Когда клетки растут на метаноле, pMMO и ICMS не образуются, а MeDH расположена в периплазме цитоплазматической мембраны. Вполне возможно, что в процессе роста на метане ICMS включают структуру, которая обеспечивает образование комплекса между pMMO и MeDH, которые могли бы позволить прямой перенос электронов от окисления метанола к окислению метана. Эта связь может включать в себя дополнительные белки и / или компоненты переноса электронов, но если это так, то они пока не известны. Недавнее исследование взаимодействий между pMMO и MeDH предполагает наличие дополнительного, неизвестного белка (Culpepper and Rosenzweig, 2014). Скорее всего, решение этой аномалии поможет понять описанную ранее проблему, касательно основной биоэнергетики в этих бактерий.

 

1.2.4. Пути ассимиляции

Выбор, который показывают пути ассимиляции, для рассмотрения конструкций обмена веществ, зависит в некоторой степени от желаемого конечного продукта, так как множество промежуточных продуктов различны в двух цепях. Рибулозомонофосфатный цикл имеет в основном сахарофосфатные интермедиаты, в то время как цикл серина включает аминокислоты, CoA производные и ТСА цикла интермедиатов. Недавний анализ рибулезоломонофосфатного цикла в метанотрофах группы I (конкретно штаммы Methylomicrobium и Methylomonas) показали, что вопреки существующим предположениям, действуйт более эффективная вариант этого цикла т. Анализ меченым углеродом С13 показал, что пируват в основном синтезируется посредством пути Embden-Мейерхольда Хоф-Парнас (EMP), в отличие от пути Энтнер-Дудорова (EDD) в клетках, выращенных в пробирках в среде метана и воздуха (Kalyuzhnaya et al., 2013). Тем не менее, возможно есть условия, при которых относительное соотношение этих двух путей может измениться, и ничего не известно о динамике потоков углерода при различных условиях питания. Эта основополагающая информация-это еще один пробел в наших знаниях, который должен быть изучен для того, чтобы прогнозировать определенные пути метаболизма для биотехнологических целей.

Ряд недавних исследований на облигатных метанотрофах Methylosinus trichosporium OB3b и факультативных метанотрофах Methylocystis Sp. SB2 и Methylocella Silvestris показали, что метанотрофный цикл серина также метаболически универсален (Yang et al., 2013;Matsen et al., 2013; Vorobev et al., 2014; Crombie and Murrell, 2014). Было показано, что работа цикла серина в метанотрофах может быть связан посредством пути этилмалонил-коэнзимаА (EMC) или пути глиоксилатного шунта (GS). Исследования меченого углерода ¹³С показали, что значительная часть углерода клеток (60%) в таких метанотрофах являются производными углекислого газа (Yang et al., 2013). Можно предположить, что в метанотрофах с циклом серина /ассимиляции GS, фиксации СО₂ способствуют не менее 50% углерода клеток. В целом, метаболический механизм является относительно энергитически затратным для С₁-ассимиляции и не удивительно, что все испытанные альфапротеобактерии метанотрофов показывают низкий выход по росту на метане в сравнении с граммположительными метанотрофами (таблица 1). Эта характеристика может означать, что внимание для использования в биотехнологии необходимо сосредоточить на метанотрофных гаммапротеобактериях Однако метанотрофные альфапротеобактерии предлагают ряд привлекательных метаболические свойств для специфического биотехнологического применения.

(1) Данная группа имеет относительно высокий поток через КоА-производные, таких как ацетил-КоА, кротонил-КоА и т. д., которые могут быть применены для производства биотоплива.

(2) Поскольку Альфапротеобактерии совместно используют метан и CO2, то эта группа микробов, скорее всего хорошо подходит для утилизации биогаза.

(3) Многие метанотрофные альфапротеобактерии показывают очень широкую метаболическую активность и способны переключаться от С₁ до С₂–С₃ соединений (Dedysh and Dunfield, 2011; Semrau et al., 2011; Crombie and Murrell, 2014).Эта последняя характеристика обеспечивает специфические преимущества для инженерии преобразования метана в метанол, такие как потенциал удаления метанолдегидрогеназы из этих организмов.

(4) И наконец, уникальная способность M. silvestri к метаболизизму Сn-алканов, что может служить в качестве основы для построения системы микробной биоконверсии природного газа или сжиженного нефтяного газа с высоким содержанием С₂–С₄ алканов (Etiope и Ciccioli, 2009). Таким образом, возможно промышленное применение метанотрофных альфа - и гаммапротеобактерии в зависимости от желаемого результата.

 

Таблица 1

Примеры генетических инструментов, используемых для изучения метанотрофии. Для более подробного списка посетите http://www.methanotroph.org.

Примеры репликативных векторов, используемые в метанотрофах

Название плазмиды	Репликон	Селективный маркер	Виды (ссылка)	Примечания
pVK100	RK2/RP4 (IncP)	Tc, Km	Methylosinus trichosporium OB3b (Lloyd et al., 1999), Methylomicrobium album BG8 (Nguyen and Chan, 2003)	Промотор зонда вектор, содержащий ген - репортер белка gfp
pSRK-Km	pBBR1	Km	Methylococcus capsulatus Bath (Welander and Summons, 2012)
pBHR1	pBBR1	Km, Cm	Methylomonas sp. st. 16a (Sharpe et al., 2007)
pMHA200	RK2/RP4 (IncP)	Km	Methylocella silvestris BL2 (Theisen et al., 2005) Methylococcus capsulatus Bath (Ali and Murrel, 2008.
pHM1	RSF1010 (IncQ)	Km, Strept	Methylosinus trichosporium OB3b (Lloyd et al., 1999)
pAWP78	RK2/RP4 (IncP)	Km	Methylomicrobium buryatense (Puri et al., 2015)