Результаты диагностики многих микробных заболеваний во многом зависят от правильного выбора материала и соблюдения следующих условий его забора, доставки, хранения и обработки.
1. Вид материала определяется клинической картиной заболевания, т.е. он должен соответствовать локализации предполагаемого возбудителя на данном этапе патогенеза болезни. Например, при бронхолегочных заболеваниях для исследования берут мокроту, при поражениях мочевой системы - мочу. В случаях отсутствия или неясности локальных очагов для исследования берут кровь.
2. Собирают достаточное количество материала (например, при исследовании крови берут 5-10 мл крови).
3. Материал берут по возможности в начальном периоде болезни, т.к. именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию. Ранний этиологический диагноз предполагает более раннее и, следовательно, более эффективное лечение и профилактику новых случаев болезни.
4. Забор материала должен осуществляться до начала антимикробной терапии. Если такая терапия начата, то ее при необходимости надо прервать на 1-2 дня, а потом производить забор материала. Так же поступают при повторных исследованиях.
5. Необходимо предупредить возможную контаминацию материала собственной нормальной микрофлорой больного и микробами окружающей среды. Для этого получение материала должно проводиться в асептических условиях, в процедурном кабинете, стерильными инструментами, в стерильную посуду. Кроме того, пути, через которые выделяется или берется материал, должны быть максимально освобождены от нормальной микрофлоры, например, прополаскиванием полостей рта и глотки при взятии мокроты, промыванием входа в уретру при заборе мочи, удалением поверхностных масс язвы, гнойной раны и др.
6. Следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектантов, антисептиков, антибиотиков), исключить контакт с металлами, обладающими олигодинамическим действием, с ватой, содержащей свободные жирные кислоты.
7. Любой клинический материал должен расцениваться как потенциально опасный для человека. Поэтому при его заборе, хранении, доставке, обработке во избежание заражения должны соблюдаться такие же меры техники безопасности, как в бактериологической лаборатории.
8. После взятия материал в возможно более короткие сроки необходимо доставить в лабораторию и начать его исследование. При отсутствии возможности быстро доставить его в лабораторию (например, ночью), его помещают в бытовой холодильник (или добавляют консервант).
9. Любой доставляемый в лабораторию материал должен иметь направление с указанием в нем названия учреждения, фамилии, имени, отчества, возраста, адреса больного, дата заболевания, вида материала, дня и часа его взятия, предполагаемого клинического диагноза, цели и метода исследования. Направление подписывает врач.
10. В процессе доставки материал следует оберегать от действия света, тепла, холода, механических повреждений. Лучше всего доставлять в специальных металлических контейнерах, которые удобно очищать и обеззараживать. Нельзя отправлять материал с больными и случайными людьми.
11. Неоднородный по консистенции материал в лаборатории гомогенизируют, например, мокроту обрабатывают муколитиками, а однородный материал может быть обогащен центрифугированием, адсорбцией.
12. После исследования остатки материала подлежат уничтожению (лучше автоклавированием или сжиганием), а посуда, контейнеры, инструменты - обеззараживанию.
Обобщенная (типовая) схема выделения возбудителей оппортунистических инфекций
Й день
1. Забор и доставка материала в лабораторию (см. выше).
2. Обработка материала с целью его гомогенизации и концентрации (в необходимых случаях).
3. Приготовление бактериального мазка, крашение его по методу Грама, микроскопия в световом микроскопе с иммерсионным объективом. В необходимых случаях, например, при подозрении на присутствие протозоа, грибов, хламидий, микобактерий, дополнительно применяют специальные методы краяшения.
4. Приготовление разведений материала в 101, 102, l03 и 104 раз в теплом 0,5% растворе хлорида натрия с 0,01% желатина (для предупреждения осмотического шока бактерий).
5. Посев одной капли I02 и 104 разведений (0,05 мл) на секторы питательных сред в бактериологических чашках или в отдельные чашки.
Посев на секторы чашки может быть сделан также калибровочной платиновой петлей с диаметром ушка в 2 мм (объем водной суспензия в этом случае равен 0,005 мл). При этой методике засевают разведения 101 и 103. В стандартный набор сред желательно включить:
· желточно-солевой агар (для стафилококков),
· среду Эндо или эозинметиловый агар (для энтеробактерий),
· кровяной агар (для стрептококков и ряда других требовательных к питательным средам видов),
· среду Сабуро (для кандид и других грибов),
· среду для контроля стерильности или другую среду для анаэробов.
В случаях, когда имеются указания на вероятный возбудитель (клиническая симптоматика, вид патологического материала, результаты микроскопии), должны быть использованы более селективные среды (например, среда с фурагином, шоколадный агар и др.).
Й день
1. Определение характера роста на питательных средах.
2. Подсчет количества колоний каждого типа на чашках с посевом разведении с перерасчетом КОЕ на один мл материала по формуле Х КОЕ = п х ФПД х ФР, где п - число колоний, ФПД - фактор посевной дозы (для капельного метода эта величина равна 20, для посева петлей - 200) и ФР - фактор разведения.
3. Микроскопия окрашенных по Граму мазков из всех типов колоний, КОЕ которых 1000 и более.
4. Отсев на среду накопления с колоний, КОЕ которых 1000 и более. В случаях забора материала из закрытых процессов для дальнейшего изучения отсевается 2-3 субкультуры, из открытых процессов - 5-6 субкультур. Эта мера вызвана гетерогенностью популяции: она удорожает исследование, но зато резко повышает его достоверность.
5. Ускоренная идентификация (при наличии методов и возможностей).
Й день
1. Установление "чистоты" культуры на средах накопления путем осмотра характера роста и микроскопией мазка.
2. Идентификация чистых культур. Тесты идентификации зависят от предполагаемого вида или рода выделенной культуры. Она проводится с помощью традиционных методик или автоматических и полуавтоматических систем.
3. Определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам и в необходимых случаях к антисептикам.
Й день
1. Учет тестов, использованных для идентификации.
2. Оформление заключения о:
· семействе, роде, виде выделенных культур;
· количестве КОЕ выделенных культур в I мл материала;
· спектре и уровнях чувствительности к антимикробным препаратам;
· этиологической значимости выделенных культур и составе, их популяций.
3. По клиническим и эпидемиологическим показаниям определяют факторы патогенности и эпидемиологические маркеры (фаго-, серо-, резистенс-, бактериоциноваров и др.) у этиологически значимых культур.
