Лабораторная работа № 5
Цель работы: изучить особенности строения вегетативных и генеративных структур отдела Ascomycota.
1. Познакомиться с особенностями полового процесса сумчатых грибов.
2. Изучить жизненный цикл аскомицетов.
3. Рассмотреть классификацию отдела и познакомиться с отдельными представителями.
Теоретические сведения:
Аскомицеты — грибы с хорошо развитым септированным гаплоидным мицелием. Септы образуются путем инвагинации, т. е. путем впячивания и роста клеточной стенки от периферии к центру. Поэтому в перегородках между клетками имеются поры, через которые перемещаются не только растворенные вещества, но и органеллы. Составными элементами клеточной стенки являются полисахариды хитин и глюканы.
Характерная особенность грибов этого класса – образование после полового процесса сумок, или асков, содержащих 4 – 8 (редко одну) аскоспор (рис. 1). Кроме того, диагностическим признаком сумчатых грибов является наличие ламеллярных двуслойных клеточных стенок с тонким электронноплотным наружным слоем и относительно толстым электронно-прозрачным внутренним слоем. 
Рис. 1. Половой цикл аскомицетов на примере жизненного цикла Neurospora crassa. Стадии 1-4 - от прорастания аскоспор до оплодотворения - вегетативная фаза; стадии 4-8 - от оплодотворения до созревания.
У базидиальных грибов они многослойные. Вегетативное размножение осуществляется участками мицелия, почкованием или путем расчленения гифы на отдельные клетки и формирования оидий, хламидоспор и т. д.
Важное место в цикле развития аскомицетов играет бесполое размножение при помощи конидий. Отдельные группы грибов могут развивать несколько видов конидиального спороношения.
Типы полового процесса определяются уровнем организации гриба. У примитивных, наиболее просто устроенных аскомицетов (класс Голосумчатые) половой процесс состоит в слиянии содержимого двух клеток (гаметангиев) мицелия и напоминает собой зигогамию или конъюгацию. Образовавшаяся зигота прямо на мицелии превращается в сумку. При этом копуляционное диплоидное ядро без периода покоя зиготы делится редукционно, затем митотически, образуя 8 гаплоидных ядер, которые облекаются цитоплазмой, формируют оболочку и превращаются таким образом в аскоспоры. Сумки у них протуникатные, т. е. с тонкой, слабо дифференцированной оболочкой, которая ослизняется или разрушается при созревании аскоспор. Такая сумка не участвует в рассеивании спор, а является лишь их вместилищем.
У высокоорганизованных аскомицетов (класс Плодосумчатые) формируются женские и мужские органы полового размножения – антеридии и архикарпы (рис. 2, а).
Рис. 2. Половой процесс у сумчатого гриба пиронемы: а – антеридий (1) и архикарп (2) с трихогиной (3); б – переход содержимого антеридия в архикарп, в – образование в аскогоне дикарионов; г – образование дикарионных аскогенных гиф (4); д, е – образование зиготы на верхушке аскогенной гифы; ж, з, и, к – мейоз и развитие сумки с аскоспорами.
Архикарп состоит из нижней расширенной части — аскогона и верхней суженной — трихогины. Содержимое антеридия, недифференцированное на гаметы, перетекает через трихогину в аскогон (рис. 2, б), где происходит плазмогамия, а гаплоидные ядра разного пола сближаются попарно, образуя дикарионы (рис. 2, в). Затем брюшко аскогона прорастает аскогенными гифами, в которых закладываются поперечные перегородки, образующие клетки с одним или несколькими дикарионамн. На концах аскогенных гиф в результате кариогамии с последующим мейозом и митозом образуются сумки с 8 аскоспорами (рис. 2, г, ж, з, и, к). Сумки возникают внутри или на поверхности плодовых тел, образуемых сплетением гиф мицелия.
Рис. 3. Типы плодовых тел аскомицетов: 1, 2 – клейстотеции; 3 – перитеции; 4 – апотеции; 5- основание гимениального слоя; 6 – сумка; 7 – парафизы; 8 – перифизы.
Различают три типа плодовых тел: 1) клейстотеции — замкнутые плодовые тела с беспорядочно расположенными внутри них сумками; 2) перитеции имеют отверстие на вершине, а сумки образуются пучком внутри плодовых тел (на дне) и способны по мере созревания активно выбрасывать споры; 3) апотеции — открытые плодовые тела, на поверхности которых палисадным слоем развиваются сумки и бесплодные гифы — парафизы (рис. 3). Совокупность сумок и парафиз составляет гимениальный слой, или гимений. Распространение спор активнее, чем в случае перитеция.
У некоторых грибов формируются ложные плодовые тела — аскостромы, по внешнему виду часто похожие на настоящие перитеции, но отличающиеся от них отсутствием собственного перидия; их оболочкой служит плектенхима стромы.
В цикле развития высших сумчатых грибов закономерно сменяют друг друга три ядерные фазы: длительная гаплоидная, представленная долгоживущим мицелием, на котором развивается конидиальное спороношение, кратковременная дикариотическая – от плазмогамии до кариогамии (существует в виде аскогенных гиф) и самая кратковременная диплоидная (диплоидное ядро материнской клетки сумки) – от кариогамии до мейоза.
Сумчатые грибы — преимущественно сапротрофы на отмерших растительных остатках, почве, пищевых продуктах, различных промышленных материалах и изделиях, вызывают их плесневение и порчу. Некоторые сапротрофы являются продуцентами антибиотиков и других биологически активных веществ. Среди сумчатых грибов встречаются съедобные виды (сморчки, строчки, трюфели) и паразиты, возбудители болезней растений, животных и человека.
Сумчатых грибов насчитывают около 30 000 видов. Аскомицеты подразделяются на 4 класса: Археаскомицеты, Гемиаскомицеты, или Голосумчатые, Настоящие сумчатые и Локулоаскомицеты. Систематика отдела основана на расположении сумок: открыто на мицелии, в особых полостях (локулах) или плодовых телах, а также на особенностях их строения (схема 1).
Схема 1. Классификация отдела Ascomycota (на схеме класс Archaeascomycetes внесен в класс Hemiascomycetes).
Класс Археаскомицеты (Archaeascomycetes)
Класс включает одноклеточные и многоклеточные грибы, у которых плодовые тела отсутствуют. Сумки у всех представителей класса эутуникатные, то есть с плотной оболочкой, часто с особым аппаратом для вскрывания и активного распространения спор.
Класс подразделяют на несколько (от 2 до 5) порядков, основным из которых является порядок Тафринальные. Порядок Тафринальные (Taphrinales). К этому порядку относятся исключительно паразиты на высших растениях, у которых они вызывают различные деформации пораженных органов (курчавость листьев, «ведьмины метлы», кармашки плодов, галлообразные вздутия и др.).
Настоящий нитчатый мицелий развивается под кутикулой или в межклетниках, однолетний или зимует в почках и побегах, легко распадается на отдельные членики. Сумки образуются пучками или в виде сплошного гимениального слоя, выступающего на поверхности пораженного органа. Сумки отходят непосредственно от мицелия или каждая помещается на отдельной подсумочной клетке в виде подставки, отделяющейся от сумки поперечной перегородкой. Сумкоспоры шаро-, эллипсовидные или продолговатые, одноклеточные, бесцветные, по 4–8 в сумке, часто в ней почкующиеся. Конидиальное спороношение у них отсутствует.
В их цикле развития наблюдается длительная дикариотическая фаза, а их сумки имеют эутуникатное строение и аскоспоры из них выбрасываются активно. Предполагают, что тафринальные филогенетически связаны с дискомицетами, а отсутствие у них плодовых тел — результат морфологического упрощения в процессе приспособления к паразитизму.
Тафринальные грибы объединены в одно семейство тафриновых (Taphrinophyceae) с одним родом тафрина, включающем около 100 видов, широко распространенных во многих странах мира Северного и Южного полушарий.
Род тафрина (Taphrina) включает грибы с эндофитным мицелием. Сумки образуются непосредственно на мицелии плотным слоем, имеющим сходство с гимением высших сумчатых грибов. Слой сумок обычно имеет желтый, красный, розовый или фиолетовый оттенок. По форме сумки могут быть цилиндрическими, булавовидными или даже удлиненными. Они достигают 60—110 мкм в высоту и 25 мкм в ширину. В основании сумок находится лишенная протопласта клетка, образовавшаяся в результате деления аскогенной клетки и сохраняющая связь сумки с гифами. В сумке 8 аскоспор округлой или яйцевидной формы, 7—10 мкм в диаметре. Они способны к почкованию, в результате чего число их в сумке может увеличиваться в 2—4 раза. Многие из тафриновых грибов гетероталличны.
Рис. 4. Жизненный цикл тафрины. А – гаплоидная стадия (дрожжи); В – дикариотическая стадия (мицелий); С – диплоидная стадия (проаски); D – развитие асков и образование половых спор. 1 – аскоспоры и почкующиеся бластоспоры (конидии); 2 – дикариотизация; 3 – дикариотический мицелий на растительной клетке, формирование аскогенного поколения; 4 – кариогамия; 5 – митоз диплоидного ядра, проаски и формирование базальных клеток; 6 – развитие асков после мейоза; 7 – митозы гаплоидных ядер, формирование аскоспор; 8 – формирование спорогенного поколения в растительных клетках.
Наиболее известны 4 вида: тафрина сливовая (Т. pruni) поражает сливу, алычу, вишню, черемуху, вызывая образование так называемых «дутых плодов» или кармашков; тафрина терносливовая (Т. insititiae) вызывает образование «ведъминых метел», волнистость и курчавость листьев слив и тернослив; тафрина тополевая (Т. rhizophora) и тафрина Визнера (Т. wiesneri), паразитирующие соответственно на тополях и вишнях или черешнях.
Класс Гемиаскомицеты, или Голосумчатые (Hemiascomycetes)
Характерный признак класса — отсутствие у грибов аскогенных гиф и плодовых тел, за что они и получили название голосумчатых. Сумки у них протуникатные, развиваются на мицелии из зиготы или аскогенных клеток и расположены беспорядочно, а у одноклеточных — в питательном субстрате. Конидиальное спороношение неизвестно. Половой процесс напоминает зигогамию у мукоральных, однако, в отличие от зигоспоры последних, зигота голосумчатых не переходит в состояние покоя, а сразу же превращается в сумку.
Основной порядок, выделяемый по строению вегетативного тела, образу жизни и особенностям цикла развития – сахаромицетальные.
Порядок Сахаромицетальные (Saccharomycetales). Порядок включает грибы, у которых сумки с 4–8 аскоспорами развиваются одиночно, прямо из зиготы. Встречаются также одно- и многоспоровые сумки. У большинства сахаромицетальных грибов настоящего мицелия нет, а вегетативное тело представлено одиночными клетками, которые размножаются почкованием или реже делением. Некоторые представители имеют хорошо развитый, ветвящийся, септированный мицелий, у которого концевые веточки часто распадаются на дрожжевидные, способные к почкованию клетки. На мицелии сначала развивается бесполое спороношение — многоядерные артроспоры в цепочках (реже удлиненные спорангии), а затем половое — гаметангии, В результате полового процесса образуется зигота, которая превращается в одно- или многоспоровую сумку или прорастает в мицелий.
Питаются сахаромицетальные преимущественно сапротрофно, но некоторые паразитируют на животных и человеке.
Род сахаромицес (Saccharomyces) включает грибы, тело которых состоит из отдельных округлых, овальных или удлиненных почкующихся клеток. Иногда образуется псевдомицелий. При почковании могут формироваться разветвленные короткие цепочки. При неблагоприятных условиях возникают эллипсовидные, шаро- или булавовидные артроспоры или 1–4-споровые сумки с округлыми, гладкими, бесцветными аскоспорами.
Описано более 50 видов и несколько десятков разновидностей, широко распространенных по всему земному шару. К роду относятся так называемые культурные дрожжи, т. е. виды и расы, получившие широкое применение в различных отраслях пищевой промышленности благодаря их способности к активному сбраживанию сахаров с образованием наибольшего по сравнению с другими дрожжами количества спирта (от 10 до 19% по объему). Из них наибольшее практическое значение имеют хлебные, или пекарские (S. cerevisiae), пивные (S. carsbergensis и S. uvarum) и винные (S. vini) дрожжи.
Пекарские дрожжи в природных условиях не встречается, а винные можно встретить в природе там, где имеются сбраживаемые ими углеводы: на поверхности ягод винограда, фруктов, в нектаре цветков, слизетечениях берез, кленов и других деревьев.
Задания
1. Для приготовления препарата тафрины необходимо иметь фиксированные в спирте пораженные листья или плоды персика, вишни, слив или черемухи. Сделать поперечные срезы через пораженные ткани. Срезы рекомендуется помещать в 5—10%-ный раствор КОН. На поверхности среза виден слой сумок на разных стадиях созревания. В зрелых сумках содержится по 8 овальных бесцветных спор. Иногда можно наблюдать их почкование. Зарисовать сумки со спорами и хламидоспоры. (Под сумкой хорошо заметна клетка — ножка, пустая клетка мицелия или хламидоспора, вырост которой развивается в сумку.)
2. Кончиком стеклянной палочки небольшое количество дрожжевой массы перенести в каплю воды на предметном стекле и, закрыв препарат покровным стеклом, рассмотреть его при большом увеличении микроскопа. Клетки хлебных дрожжей имеют округло-эллипсовидную форму (одиночные или соединенные по 2–4 в цепочки), а винные – в виде ветвистых колоний, состоящих из цилиндрических клеток. На многих клетках можно видеть маленькие выпуклины — почки. В мелкозернистом содержимом живых клеток дрожжей хорошо заметны крупные, прозрачные вакуоли, занимающие обычно центральное положение. Зарисовать клетки дрожжей обоих видов.
