Классификация пектолитических ферментов

Гемицеллюлазы

Как уже отмечалось, состав клеточной стенки растения различен и представлен в виде комплекса полисахаридов, которые главным образом представлены в виде длинных цепочек целлюлозы, пектина и гемицеллюлоз.

Происхождение, распределение и структурные особенности полисахаридов клеточной стенки растения определяются: видовой специфичностью; типом ткани, условиями роста и созреванием. Основные различия в строении гемицеллюлозных компонентов клеточной стенки существуют между однодольными растениями (например, зерновые растения и травы) и двудольными (например, клевер, соя) и между семенем и вегетативными частями растения.

Однодольные растения характеризуются присутствием арабиноксиланового комплекса в качестве основного гемицелюлозного каркаса. Основная структура гемицеллюлоз в двудольных растениях представляет собой ксилоглюкановый комплекс. В двудольных найдены более высокие, чем в однодольных растениях концентрации пектина. Семена содержат, главным образом, пектиновые вещества и относительно низкое количество целлюлозы.

Первичная стенка клетки зрелых, метаболически активных клеток растения (например, мезофилл и эпидерма) более чувствительна к ферментативному гидролизу, чем вторичная клеточная стенка клетки, которая, становится высоко лигнифицированной. Наблюдается высокая степень взаимодействия между целлюлозой, гемицеллюлозой и пектином в стенке клетки, поэтому ферментативная деградация этих связанных полисахаридных структур представляет собой довольно сложный процесс.

В процессах распада полисахаридов растительной клеточной стенки принимают участие: Ксиланаза, эндоксиланаза-1.4-β-ксилан-ксиланогидролаза (КФ 3.2.1.8); Пектиназа, эндополигалактуроназа -1,4-α-полигалактуронан-галактуронаногидролаза (КФ 3.2.1.15); Галактозидаза (мелибиаза)- галактозидгидролаза (КФ 3.2.1.25); Экзо-1,3-β-ксилозидаза- 1,3-β-D-ксилан-ксилогидролаза (КФ 3.2.1.32); Экзо-1,4-β-ксилозидаза -1,4-β-D-ксилан- ксилогидролаза (КФ 3.2.1.37); Эндо-1,3-β-глюканаза -1,3-β-глюкан-глюканогидролаза(КФ 3.2.1.39); L-рамнозидаза - рамнозилгидролаза (КФ 3.2.1.40); L-фукозидаза- α-фукозидгидролаза (КФ 3.2.1.51); L-арабинофуранозидаза - α-L-арабинофуранозидгидролаза (КФ 3.2.1.55); Экзо-1,3-β-глюканаза-1,3-β-глюкан-глюкогидролаза (КФ 3.2.1.58); 1,2-α-L-фукозидаза-2-O-альфа-L-фукопиранозил-β-галактозид фукогидролаза (КФ 3.2.1.63); Экзополигалактуроназа-1,4-альфа-полигалактуронан-галактуроногидролаза (КФ 3.2.1.67); Экзо-1,3-β-ксилозидаза-1,3-β-ксилан-ксилогидролаза (КФ 3.2.1.72); Эндоманнаназа-1,4-β-маннан-маннаногидролаза (КФ 3.2.1.78); Экзопектиназа, экзополигалактуроназа -,4-α-Полигалактуронан-дигалактуроногидролаза (КФ 3.2.1.82); Эндо-1,4- -D-галактаназа -1,4-β-арабиногалактан-галактаногидролаза (КФ 3.2.1.89); Эндо-1,3- -D-галактаназа -1,4-β-арабиногалактан-галактаногидролаза (КФ 3.2.1.90); Эндо-арабинаназа -1,5-α-L-арабинан-1,5-α-L-арабинаногидролаза (КФ 3.2.1.99); Экзо-β-маннаназа - 1,4-β-маннан-маннобиогидролаза (КФ 3.2.1.100).

Гемицеллюлозы после целлюлозы являются наиболее обильным возобновляемым полисахаридом в природе. Для экономичной биоконверсии растительного сырья в жидкое топливо и другие ценные химические соединения важно, чтобы гемицеллюлозы (ксиланы, галактаны, арабинаны, глюкананы, маннаны) были полностью утилизируемы. В ряде случаев, полная деградация гемицеллюлозы до мономеров не обязательна. Для сжижения арабиноксилана, например, требуется просто разрушать полисахаридный каркас ксилана до более коротких фрагментов. Это может быть достигнуто действием эндоксиланаз, в результате действия которых образуется смесь мономеров и олигомеров ксилозы, таких как, например, ксилобиоза и ксилотриоза. Эти более короткие субъединицы достаточно растворимы для последующего использования.

Известно много микроорганизмов в том числе грибов и бактерий, способных образовывать большие количества ферментов, разлагающих гемицеллюлозы. В природе они всегда проявляются вместе с другими полисахариддеградирующими ферментами.

Гемицеллюлазы (КФ 3.2.1) — это системы ферментов, ката­лизирующих гидролиз гемицеллюлоз до мономеров их образующих. Ферменты гемицеллюлазной системы называют в соответ­ствии с тем субстратом, расщепление которого они катализиру­ют. Так, ферменты, катализирующие гидролиз арабиноглюкуроноксиланов, арабиноксиланов, 4-О-метилглюкуроноксиланов, на­зывают ксиланазами, а расщепляющие глюкоманнаны, галактоглюкоманнаны, галактоманнаны — маннаназами. К гемицеллюлазам часто относят ферменты, катализирующие расщепление нейтральных пектиновых полисахаридов α-L -1,5-арабинанов, 1,4-β-D-галактанов, которые соответственно называются арабиназами и галактаназами. При расщеплении гемицеллюлоз гемицеллюлазы кооперативно или синергически взаимодействуют с участ­вующими в расщеплении глюкозидазами, такими как:

α -L-арабинофуранозидаза (КФ 3.2.1.55) — участвует в гидро­лизе арабиноглюкуроноксиланов, арабиноксиланов, α -L-l,5-apaбанов;

β -ксилозидаза (КФ 3.1.1.37) — участвует в гидролизе 1,4- β -D-ксиланов;

β -маннозидаза (КФ 3.2.1.25), α -галактозидаза (КФ 3.2.1.22), β -глюкозидаза (КФ 3.2.1.21) — участвуют в расщеплении галактоглюкоманнанов;

β -галактозидаза (КФ 3.2.1.23) — участвует в гидролизе β -D-галактанов.

Ферментативный гидролиз гемицеллюлоз изучен меньше, чем таковой для целлюлозы. Частично это связано с тем, что гемицеллюлозы, обычно имеющие разветвленную структуру, не яв­ляются гомополисахаридами (состоящими из сахарных остатков только одного типа), а представляют собой гетерополисахариды, в состав которых входит как минимум от 2 до 4 типов сахаров.

Гемицеллюлазы широко применяют при переработке растительного сырья для ком­плексного осахаривания гемицеллюлоз. Кроме гидролиза гемицеллю­лоз с целью получения энергии (в виде жидкого топлива) и раз­личных химических соединений, гемицеллюлазы применяются в пищевой промышленности для обработки фруктов, овощей, круп, бобовых, в хлебопечении и пивоварении. С помощью этих ферментов можно получить глюкозу и пентозы, которые могут использоваться для производства кормовых белковых препаратов, в кормопроизводстве, для получения фурфурола, этанола, ксилита, биогаза и других продуктов микроб­ного синтеза.

В зависимости от типа гидролизуемого субстрата, все фер­менты гемицеллюлазного комплекса делятся на ксиланазы, галактаназы, маннаназы, арабинаназы (табл.7).

Таблица 7

Характеристика ферментов, участвующих в гидролизе гемицеллюлоз

 

Фермент	Субстрат	Конечный продукт реакции	Тип гидролизуемой связи
β-Ксилозидаза (КФ 3.2.1.37)	Ксилан, ксилооли-госахариды	Ксилоза	β -1,4-
Эндоксиланаза (КФ 3.2.7.8)	Ксилан (линейный и разветвленный)	Ксилобиоза и ксилотриоза	β -1,4-; α-1,2-; α -1,3-
	Ксилан (линейный и разветвленный)	Ксилоолигосахариды	β -1,4-; α -1,2-; α -1,3-
	Ксилан линейный	Олигосахариды	β -1,4-
	Ксилан (линейный и разветвленный)	Ксилобиоза и ксилоза	β - 1,4-; α-1,2-
α-L-арабинофу-ранозидаза (КФ 3.2.1.55)	Арабиноксилан (боковые цепи); арабинан; арабино-галакган; арабино-олигосахариды	L-арабиноза	α-1,5-; α -1,3-
α-D-глюкурони-даза	Ксилан (боковые цепи)	D-глюкуроновая кислота; ксилан	α -1,3-
Ацетилэстераза (КФ 3.1.1.6)	Ацетилированный ксилан	Ацетат; ксилан
Эндо-1,4-β-D-галактаназа (КФ 3.2.1.89)	1,4- D -галактан	Галактоолиго-сахариды; галактоза	β -1,4-
β-1,3-О-галакта-наза	Арабино-1,3-D-га-лактан	L-арабиноза; D-гaлактоза; галактобиоза; β -D-галактооли-госахариды	β -1,3-

 

Ксиланазы

Ксиланазами называют системы ферментов, катализирующих гидролиз ксиланов, арабиноксиланов, арабиноглюкуроноксиланов, глюкуроноксиланов, 4-О-метилглюкуроноксиланов до мо­носахаридов и уроновых кислот. На рис. 36 показана структура растительного ксилана и места, в которых он может быть атако­ван ксиланолитическими ферментами. Линейная структура 1,4- β -D-ксилана, состоящая из остатков D-ксилозы, разветвлена гете-рополисахаридами с образованием боковых цепей. Точки ветв­ления содержат L-арабинофуранозу, связанную с мономерными остатками ксилозы α -1,3-связью, и D-глюкуроновую кислоту (или 4-О-метил- D -глюкуроновую кислоту), соединенных с ксиланом α -1,2-связью. Ксилан может быть также ацетилирован. Более часто ацетилирование встречается у гидроксильных групп в положении 3, чем в 2.

Ферменты, катализирующие расщепление ксиланов, образу­ют бактерии, актиномицеты, фитопатогенные грибы и грибы-сапрофиты, простейшие, моллюски, насекомые, высшие расте­ния. Ксиланазы были обнаружены в тканях позвоночных животных и человека. У позвоночных животных ксиланы гидролизуются бактериальной флорой кишечного тракта. В расщепле­нии 1,4-β-D-ксиланов, глюкуроноксиланов, арабиноглюкуроно-ксиланов участвуют следующие ферменты:

КФ 3.2.1.8 — эндр-1,4-β-ксиланаза, 1,4-β-D-ксиланксилано-гидролаза, характеризующаяся эндодействием на 1,4- β-D -ксилозидные связи в ксиланах.

КФ 3.2.1.37 — экзо-1,4- β -ксилозидаза, которая гидролизует 1,4- β-D-ксиланы с последовательным отщеплением остатков D-ксилозы от нередуцирующего конца.

КФ3.2.1.55—α-L-арабинофуранозидаза,

α-L-арабинофуранозидарабинофураногидролаза катализирует гидролиз концевых нередуцирующих остатков α -L-арабинофуранозидных остатков в α-L-арабинофуранозидах, α -L-арабинанах, содержащих 1,3- и (или) 1,5- связи, до арабиноксиланов и арабиногалактанов.

Многочисленные ксиланазы различного молекулярного веса известны y таких микроорганизмов как, например, Aspergillus niger, Clostridium thermocellum, Trichoderma reesei, Penicillium janthinellum, а так же у Вacillus и Streptomyces. В дрожжах - Trichosporon, Cryptococcus и Aureobasidium было выявлено только по одной ксиланазе.

Между физическими характеристиками ксиланаз грибного и бактериального происхождения существуют некоторые различия. Первые имеют рН оптимум в диапазоне рН 3,5-5,5, а бактериальные - 5,0-7,0. Грибные ксиланазы также имеют более широкий pН диапазон стабильности (pН 3-10), чем их бактериальные аналоги (pН 5,0-7,5). Температурный оптимум у грибных ксиланаз около 50ºС, а для бактериальных ксиланаз он лежит между 50 и 70ºС. Ясно, что бактериальные ксиланазы меньше подходят для использования в процессах, требующих более низких условий рН. С другой стороны, эти же ферменты слишком термостабильные для некоторых применений как, например, осветление пива.

Ac Araf

| |

3 3

- 4Xyl1- 4Xyl1- 4Xyl1- 4Xyl1- 4Xyl1- 4Xyl1- 4Xyl1- 4Xyl1- 4Xyl1-

2 2 2

| | |

 Ac 

MeGlcA MeGlcA

 

- 4Xyl1- 4Xyl1-

 

β- ксилозидаза (КФ 3.2.1.37)

α-L-арабинофуранозидаза (КФ 3.2.1.55)

α-глюкуронидаза (3.2.1.)

ацетилэстераза (КФ 3.1.1.6)

эндо-1,4-β-ксиланаза (3.2.7.8)

Рис. 36. Гипотетический растительный ксилан и места, в которых он может быть атакован ферментами: Ac -ацетильные группы; Araf- арабинофураноза; MeGlcA -4-О-метил-D-глюкуроновая кислота; D -глюкуроновая кислота; Xyl- D-ксилоза

 

Механизм гидролиза ксиланазного полимера должен быть сходным с аналогичным процессом у других карбогидраз (в том числе и целлюлаз), где два кислых остатка аминокислот выступают в качестве нуклеофила и кислотно-основного катализатора. Так, ксиланаза из Bacillus pumilus DSM штамм 6124 имеет в каталитическом центре два глутамата - Glu 93 и Glu 182

Расщепление ксиланов у эволюционно отдаленных организмов происходит с участием ферментов семейств 10/F и 11/G. Ферменты семейства 10, более предпочтительно действуют вблизи восстанавливающего конца полимера, подобно грибной эндоглюканазе II. Их активный центр имеет форму расщелины и состоит из шести сайтов связывания пиранозных остатков: -2,-1,+1,+2,+3,+4. Протяженность агликоновой части активного центра согласуется со способностью ферментов к трансгликозилированию при низких концентрациях акцептора.

Небольшие по размерам ксиланазы II грибов, принадлежащие к семейству 11 тмеют активный центр в виде ложбины. Он образован у них завернутыми краями β-сэндвича и содержит два каталитически активных остатка E86 (предположительно нуклеофил) и E177 (предположительно общий кислотно-основной катализатор). В процессе катализа активный центр претерпевает конформационные изменения, в ходе которых изменяется положение остатков Y137 и L164. В конформации, подготовленной для связывания субстрата, активный центр открыт, а при связывании он закрывается, причем каталитически активный остаток E177 в этих условиях меняет положение в зависимости от рН. Активный центр частично приоткрыт в “ослабленной” конформации и делает возможной диффузию отщепленной части субстрата.

Более десятка грибных гемицеллюлаз несут ЦСД и вовлечены в реакции на поверхности целлюлозы. Известны два типа таких ферментов – это ксиланаза Fusarium oxysporum (семейство 10/F) и β-маннаназа T. reesei (семейство 5/А1). Эти ферменты, очевидно, участвуют в деградации той части ксиланов и маннанов, которая тесно ассоциирована с поверхностью целлюлозы и имеет более упорядоченную надмолекулярную структуру.

Грибные ксиланазы семейств 10/F и 11/G отличаются по характеру действия на метилглюкуроноксилан и родименан (1,3(4)-β-ксилан). Более высокомолекулярные ферменты семейства 10 образуют из этих субстратов в качестве минимальных фрагментов альдотетрауроновую кислоту и (Xyl)₃ с центральной 1,3-β-связью, соответственно. Низкомолекулярные ферменты семейства 11 из T. reesei и стрептомицетов образуют пентамер и (Xyl)₄, что свидетельствует о меньшем, чем у семейства 11 субстрат-связывающем участке активного центра у ксиланаз семейства 10, несмотря на больший размер КД со структурой ТИМ-бочки. Некоторые ферменты семейства 10 превращают не только ксилозиды, но и соответствующие β-глюкозиды. Отмечена способность ряда ферментов семейства 10 отщеплять ароматический хромо- или флуорофор от β-целло- или -ксилобиозидов. Оба семейства ферментов (10 и 11) сохраняют конфигурацию при аномерном центре.

В составе термостабильных модульных ксиланаз термофильных бактерий Caldibacillus cellulovorans и Caldicellulosiruptor cellulolyticum выявлен особый тип ксилансвязывающего домена, который первоначально получил название TSD (thermostabilizing domain), так как его удаление приводило к снижению температурного оптимума действия ксиланаз на 10ºС. У него, затем была обнаружена способность связываться с растворимым ксиланом и оксиэтилцеллюлозой. Содержащая его модульная эндоксиланаза XynA на N-конце имеет на С-конце дополнительно два ЦСД семейства IIIb.

У анаэробной бактерии Fibrobacter succinogenes ксиланаза С состоит из двух КД семейства 11/G и третьего домена невыясненной природы. Первый из доменов активен по отношению к ксилану, второй – к арабиноксилану. Анаэробная бактерия Ruminococcus flavefacien s содержит ксиланазу А, которая состоит из N-концевого домена семейства 11/G, образующего ксилоолигосахариды при гидролизе ксилана, и С-концевого домена семейства 10/F, образующего ксилозу. Ксиланаза D содержит тот же N-концевой домен, но присоединенный к С-концевой 1,3(4)-β-глюканазе. Еще одним примером являются ксиланазы псевдомонад, домены которых выполняют роль сопряженного фермента - ацетилксиланэстеразы.

Расшифровка нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих два типа ксиланаз и ацетилксиланэстеразу из Streptomyc thermoviolaceus OPC-520 показала, что они кодируют белки 51, 35.2, и 34.3 kDa соответственно, которые, как и большинство целлюлаз, содержат по две функциональные области - каталитический и субстрат связывающий домены.

Ген ацетилксиланэстеразы AxeA анаэробного гриба Orpinomyces sp. PC-2 кодирует полипептид из 313 остатков с массой 34,845 Da. Из рекомбинантной E. coli выделен активный белок, выделяющий ацетат из ацетилксилана. Ацетилксиланэстераза (AxeA) на 56 % идентична BnaA ацетилксиланэстеразе Neocallimastix patriciarum, но не содержит некаталитического повтора (NCRPD) на С-конце как у Neocallimastix BnaA. Отсутствие докерина показывает, что AxeA может быть свободно функционирующим ферментом, а BnaA – компонентом целлюлазно-гемицеллюлазного аггрегата. Эти ферменты, по-видимому, представляют собой новое семейство гидролаз.

Ксиланазы XynY и XynZ клостридий состоят из нескольких доменов. C- и N-концевой домены XynY и XynZ, соответственно, гомологичны ферулоилэстеразе анаэробного гриба Orpinomyces PC-2. Целлюлосомы C. thermocellum гидролизуют FAXX (O-5-O-[(E)-ферулоил]-α-L-арабинофуранозил-(1,3)-O-β-D-ксилопиранозил-(1,4)-D-ксилозу) и FAX(3) (5-O-[(E)-ферулоил]-[O-β-D-ксилопиранозил-(1,2)]-O-α-L-абинофуранозил-[1,3]-O-β-D-ксилопиранозил-(1,4)-D-ксилозу) с образованием ферулата. Домены XynY и XynZ, клонированные в Escherichia coli, гидролизовали FAXX and FAX(3). FAE(XynZ) и FAE-CBD(XynZ).

Ксиланаза А бактерии P. fluorescens subsp. сellulosa принадлежит семейству 10/F, действует, очевидно, с восстанавливающего конца и способна к трансгликозилированию при относительно низких концентрациях субстрата. Особенностью ее структуры является наличие Са²⁺-связывающего сайта. Она несет N-концевой ЦСД семейства IIа и внутренний ЦСД семейства Х, как и эндоглюканазы. В отличие от нее XynB/C и XynD, принадлежащие тому же семейству 10/F, имеют только N-концевой ЦСД типа IIa, а XynE семейства 11 – только С-концевой ЦСД типа Х.

Ксиланаза из Pseudomonas fluorescens subsp. cellulosa одна из описанных ксиланаз, которая имеет в своей структуре участок, связывающий кальций, хотя большинство известных глюкозилгидролаз не связывают Ca²⁺. Возможно, что связывание кальция может стабилизировать структуру фермента от термической инактивации и (или) протеолитической атаки.

Новое применение ксиланаз основано на их способности, удалять лигнин из древесной пульпы, что сокращает количество хлора, необходимое для отбеливания, и, соответственно, снижает токсичность промышленных стоков.

Предварительная обработка с использованием ксиланаз сократила потребность в хлоре для отбеливания на 20- 25% для лиственных и только на 10 - 15% для хвойных пород. Показано, что молекулярный размер ксиланаз и структура поры пульпы определяют количество лигнина, который может быть удален с помощью ксиланаз.

Так, при использовании ксиланаз с молекулярными весами 20.000 Da, 39.000 Da и 67.000 Da из лиственной пульпы удаляется 48% 39%, и 30% лигнина соответственно.

Для увеличения размеров пор пульпы можно проводить предобработку целлюлазами, что дополнительно уменьшает затраты хлора на отбеливание - 31% для хвойной и 41,8% для лиственной пульпы.

 

Арабиназы

 

Арабинаны встречаются в зерне, фруктах, овощах, в древесине. Они состоят из α -L-арабинофуранозильных остатков, соединенных 1.5-связью, а в боковых цепях α- 1.3-связью. К ферментам, катализирующим гидролиз α -L-арабиннанов, относятся:

1. Арабинозидаза, α -L-арабинофуранозидаза (КФ 3.2.1.55), которая активна по фенил-α-L-арабинофуранозиду (α -(1-5)-) и разветвленным арабинанам (α -(1-3)-) с более высокой редуцирующей активностью по линейному 1,5-a-L-
арабинану. Фермент отщепляет мономеры L-арабинозных еди­
ниц от невосстанавливающего конца субстрата, а
также способны отщеплять α-L-арабинофуранозильные сахар­
ные остатки от арабиноксиланов и арабиногалактанов. L-Араби-
ноза является конкурентным ингибитором для ферментов этого
типа.

2. Арабинан-эндо-1,5- α-L-арабинозидаза (эндо-1,5-а-Ь-арабиназа) (КФ 3.2.1.99) осуществляет эндогидролиз 1,5- α-L -арабиноз-фуранозильных связей 1,5-арабинанов. Арабиназы синтезируют бактерии, грибы, высшие растения и беспозвоночные. Наиболее изучены α-L-арабиназы грибов. У грибов найдены арабиназы, связанные с клеткой, и внеклеточные. Оптимальная активность α-L-арабиназ грибов отмечается при рН 2,5-6. Молекулярныемассы этих ферментов обычно варьируют в пределах 15-63 кДа, но у Sclerotinia fructigena была найдена арабиназа с молекуляр­ной массой 200-350 кДа.

Описаны арабинофуранозидазы, которые не проявляют ак­тивности по отношению к полимерным линейным и разветв­ленным арабинанам, но способны деградировать арабиноолигосахариды.

 

Галактаназы, манназы

Описаны два типа галактанов: состоящие из цепей β-D-галактопиранозильных остатков, соединенных либо 1,4-, либо 1,3- связью. Основная цепь молекулы галактана с -1,3- связью содержит при 6 атоме углерода 1,6-β-последовательности β-D-галактопиранозильных остатков и L-арабинофуранозильные группы в 3 и 6 положениях. β-1,4- галактаны могут существовать как сами по себе, так и быть связанными с L-арабинофуранозильными группами или остатками глюкурониловой или галактуроновой кислот.

Известен фермент, гидролизующий случайным образом арабиногалактан в кофейных зернах до L-арабинозы, D-галактозы, галактобиозы (β-1,6-связь) и серию β-D-галактоолигосахаридов.

Клонированы также эндоманнаназа Мan26А и β-маннозидаза Мan2A Cellulomonas fimi. Man26A – секретируемый модульный белок из 951 остатка с КД семейства 26, модулем S-слоя и двумя доменами неизвестной функции. Эндоманнаназа Man26A частично ассоциирована с клетками у С. fimi. и у исходного организма является очевидно единственной маннаназой. β-маннозидаза Man2A является внутриклеточным ферментом с КД из семейства 2.

В расщеплении арабиногалактанов и галактоглюкоманнанов участвуют нижеприведенные ферменты:

КФ 3.2.1.89 — эндо-1,4-β-D-галактаназа, галактаназа, араби-ногалактан эндо-1,4- β-D-галактозидаза, катализирует эндогидролиз 1,4- β-D -галактозидных связей в арабиногалактанах. Обна­ружены у бактерий, грибов, высших растений. Арабиногалактан соевых бобов под действием бактериальных 1,4-р-галактаназ расщепляется до галактозы, галактобиозы, галактотриозы. Арабиноза не была найдена даже при деградации арабиногалактана на 28-34%.

КФ 3.2.1.23 — β -галактозидаза, β-D-галактозидгалактогидролаза, катализирует гидролиз концевых невосстанавливающих β-D-галактозных остатков в β-D-галактозидах. Этот фермент синтезируют грибы, дрожжи, бактерии, высшие растения, жи­вотные. Бактерии в большинстве своем образуют внутриклеточ­ные β-галактозидазы. Микроскопические грибы синтезируют внеклеточные и внутриклеточные β -галактозидазы.

КФ 3.2.1.22 — α-галактозидаза, α- D -галактозидгалактогидро-лаза катализирует гидролиз концевых невосстанавливающих, α -D-галактозных остатков в α -D-галактанах. Кроме гидролити­ческой активности проявляет трансгликозилирующую актив­ность. Этот фермент обнаружен у бактерий, актиномицетов, грибов, дрожжей, высших растений, в организмах животных, че­ловека. Молекулярные массы a-галактозидаз из бактерий около 300-370 кДа. У грибов обнаружены высокомолекулярные (500 кДа) и низкомолекулярные (45 кДа) α-галактозидазы.

КФ 3.2.1.78 — эндо-1,4-β-D-манназа, маннан-эндо-1,4- β-D -маннозидаза катализирует неупорядоченный гидролиз 1,4- β-D -маннозидных связей в галактоманнанах, глюкоманнанах, маннанах. Образуют эндо-1,4- β-D-манназы бактерии, грибы, выс­шие растения, беспозвоночные животные. Молекулярная масса фермента колеблется в пределах 22-47 кДа.

КФ 3.2.1.25 — β -маннозидаза, катализирует гидролиз конце­вых невосстанавливающих р-В-маннозидных остатков в β-D -маннозидах.

КФ 3.2.1.100 — маннан-1,4- β -маннобиозидаза, экзо-1,4-β-маннобиогидролаза катализирует гидролиз 1,4- β-D -маннозидных свя­зей в 1,4- β-D маннанах, чтобы последовательно отщеплять ман-нобиозные остатки от невосстанавливающих концов цепи.

Расщепление галактоманнана микроорганизмами рубца про­исходит по схеме:

Галактоманнан → Маннан

α-Галактозидаза ↓ ↓ Эндо-1,4-β-маннаназа

Галактоза Маннодекстрины

 

↓ β-Маннозидаза

 

Манноза

 

Пектиназы

Пектиновые вещества многокомпонентны и входят в состав всех растительных тка­ней; регулируют водный обмен растений; являются промежу­точным звеном в поглощении и транспорте ионов. Молекуляр­ная масса пектинов, выделенных из различных материалов, ко­леблется в пределах от 20 до 360 кДа.

Гидролиз пектиновых полисахаридов в природных биоцено­зах осуществляют микроорганизмы. Высшие животные и чело­век не продуцируют пектолитические ферменты. Распад пекти­новых веществ происходит под действием ферментов микро­флоры кишечника. Пектолитические ферменты (пектиназы) со­держат многие растения, но они не являются промышленными источниками получения ферментов. Наибольшей продуцирую­щей способностью обладают микроскопические грибы рода Aspergillus. Различные виды грибов рода Penicillium, Botrytis, Trichoderma, Fusarium, Sclerotinia также продуцируют пектолитические ферменты. Способность к биосинтезу пектиназ отмечается у различных бактерий родов Clostridium, Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas.

Пектиназы рассматриваются как ферменты, модифицирую­щие клеточную стенку растений. После их действия другие по­лисахариды клеточной стенки могут атаковаться разлагающими их ферментами.

Классификация пектолитических ферментов

Пектолитические ферменты условно подразделяются на две группы: гидролазы и трансэлиминазы. В гидролизе пектиновых веществ участвуют пектинэстеразы и полигалактуроназы. Негид­ролитическое расщепление пектиновых веществ катализируют ферменты из класса лиаз — пектинтрансэлиминазы.

Пектинэстераза (пектинметилэстераза, КФ 3.1.1.11) гидролизует сложноэфирные связи пектина с образованием метилового спирта и полигалактуроновой кислоты с низкой степенью этерификации. Показано, что пектинэстераза (ПЭ) отщепляет СНз-группу только в том случае, если вблизи омыляемой связи нахо­дится хотя бы одна СООН-группа.

Действие ПЭ специфично по отношению к D-галактуронану. Наибольшее сродство ПЭ проявляет к метальному остатку в по­ложении 5 (I), так как в положении 6 и 4 имеются свободные СООН-группы. Омыление эфирной связи в положениях 3 и 7 происходит во вторую очередь (II), так как сродство ПЭ к раз­рыву этих эфирных связей меньше, чем к той же связи в поло­жении 5.

Механизм действия ПЭ может быть представлен в виде схемы:

 

ПЭ (II) ПЭ(I) ПЭ(II)

 

 

Пектинэстераза не осуществляет полную деэтерификацию пектина, а отщепляет лишь 60‑75% метильных групп. Активность фермента тем больше, чем выше степень этерификации субстрата. Скорость гидролиза снижается по мере деметоксилирования пектина и полного отщепления метоксильных групп не наблюдается. Одновалентные и двухвалентные катионы стимулируют активность фермента. Конечные продукты реакции ведут себя как конкурентные ингибиторы. Наиболее активна ПЭ бактерий при рН 7,0‑8,5. Грибная ПЭ имеет оптимум рН от 4,5 до 5,5, а полученная из растений — 6,0‑8,0.

Полигалактуроназы (ПГ) катализируют гидролиз α-1,4-глико-зидных связей в субстрате различной степени этерификации. Микроорганизмы и высшие растения обычно синтезируют по-лигалактуроназы, расщепляющие предпочтительно низкоэтери-фицированный субстрат. При воздействии на высокоэтерифицированный субстрат первая стадия гидролиза проходит под влиянием пектинэстеразы. После частичного деметоксилировния пектина начинается гидролиз полигалактуроновой кислоты. Снижение молекулярной массы пектина приводит к замедлению деметоксилирования.

Некоторые исследователи считают, что существует фермент — полиметилгалактуроназа (ПМГ), деградирующий высокоэтерифицированные α-D-галактуронаны неупорядоченным способом. Однако после открытия пектинлиазы (ПЛ) было показано, что большая часть ферментов, расщепляющих высокоэтерифицированные D-галактуронаны, действует по механизму β-элиминирования.

Среди полигалактуроназ выделяют эндо-D-галактуроназы (эндо-ПГ) и экзо-D-галактуроназы (экзо-ПГ).

Эндополигалактуроназы (КФ 3.2.1.15) катализируют гидроли­тическое расщепление а-1,4-гликозидных связей между неэтерифицированными остатками полигалактуроновых кислот не­упорядоченным образом с предпочтительным расщеплением внут­ренних связей полимера. При этом происходит падение вязкости галактуронана (пектиновой или полигалактуроновой кислоты). Даже незначительное расщепление α -1,4-связей (1-10%) приводит к снижению вязкости примерно на 50%. Основными продукта­ми действия эндо-ПГ являются олигоурониды и небольшие ко­личества ди- и моногалактуроновых кислот. Они могут быть по­лучены в результате реализации либо многократного последова­тельного действия на единичные звенья полимера, при котором формируются эти продукты, либо в результате мультицепочеч-ного действия, при котором мономеры, димеры и тримеры образуются на конечной стадии гидролиза при расщеплении выс­ших олигогалактуронатов.

Первый механизм обнаружен у фермента из культуры Colletotrichum lindemuthianum, а второй — у ферментов из Saccharomyces fragilis.

Активность эндо-ПГ снижается по мере расщепления суб­страта. Олигоурониды гидролизуются медленнее, чем полимер­ный субстрат. Изучение действия эндо-ПГ на низкомолекуляр­ные субстраты выявило три группы полигалактуроназ: А, В и С. К группе А относится полигалактуроназа из дрожжей Saccharomyces fragilis и Aspergillus niger. Она практически не способна расщеплять тример (тригалактуроновую кислоту) или гидролизу-ет его очень медленно. В группу В включена полигалактуроназа, обнаруженная у томатов и способная относительно быстро гид-ролизовать тримеры. Эта полигалактуроназа быстрее расщепляет первую связь, чем вторую от восстанавливающего конца, а тре­тья связь от восстанавливающего конца не гидролизуется. Полигалактуроназы, найденные у культуры Erwinia carotovora, при­надлежат к группе С. Они отличаются специфическим гидроли­зом пентасахарида, расщепляя только вторую связь от восста­навливающего конца, образуя дигалактуроновые кислоты из восстановленных или окисленных тетрамеров. Полигалактурона­за из Erwinia carotovora не расщепляет дигалактуронат, но пол­ностью гидролизует тригалактуроновую кислоту.

Механизм действия эндо-ПГ на олигоураниды зависит от строения активного центра. Активный центр полигалактуроназы из Aspergillus niger состоит из четырех мест связывания и ката­литической группы, расположенной между 1 и 2-м участками связывания. С пента- и гексамерами образуются соответственно два и три продуктивных комплекса; с тримером, когда связыва­ются 1-3-й участки, — один продуктивный, а в случае присое­динения 2-4 участков связывания — один непродуктивный ком­плекс. В активном центре эндо-ПГ из Aspergillus niger содержат­ся карбоксильные и имидазольные группы гистидина, которые участвуют в связывании фермента и субстрата.

Активность полигалактуроназ определяется по снижению вяз­кости растворов полигалактуроновой кислоты и содержанию восстанавливающих групп образующихся олигогалактуроновых кислот.

Большинство исследованных эндополигалакгуроназ имеют мо­лекулярную массу 20-80 кДа. Продуцируются эндополигалакгу-роназы бактериями, фитопатогенными и сапрофитными гриба­ми, высшими растениями. Обнаружены они и в кишечном трак­те животных. У микроорганизмов найдены разнообразные фор­мы эндополигалактуроназ. Оптимальное значение рН большин­ства эндо-ПГ находится в интервале от 4 до 5,5.

Экзополигалактуроназы (КФ 3.2.1.67) (экзо-ПГ) катализируют гидролиз α-1,4-гликозидных связей между остатками неэтери-фицированной галактуроновой кислоты в полигалактуроновой кислоте, пектатах. Экзо-ПГ не гидролизуют пектаты полностью. Степень гидролиза обычно составляет 40-50%. При действии эк­зо-ПГ падение вязкости раствора пектата на 50% сопровождает­ся расщеплением 30-45% гликозидных связей.

Грибные экзополигалактуроназы проявляют максимальную активность при рН 4-6 и образуют в качестве основного конеч­ного продукта моногалактуроновую кислоту. Фермент из бакте­рий Erwinia aroideae атакует субстрат с нередуцирующего конца цепи при рН 7,2, образуя моно- и дигалактуроновую кислоту.

Экзо-ПГ с большей скоростью гидролизует частично дегра­дированный субстрат. Однако в некоторых случаях длина цепи не определяет скорость гидролиза субстрата. Так, внеклеточная экзополигалактуроназа из Aspergillus niger не проявляет строгой специфичности к длине цепи субстрата.

Олигогалактуроназы (КФ 3.2.1.40) (ОГ) синтезируются рядом микроорганизмов. Это внутриклеточные ферменты, гидролизующие предпочтительно низкомолекулярные олигогалактурониды. Олигогалактуроназа атакует субстрат с нередуцирующего конца. Наиболее активна олигогалактуроназа по отношению к тримеру, с возрастанием степени полимеризации ее активность уменьша­ется.

Пектинтрансэлиминазы, или пектатлиазы (ПТЛ), осуществляют расщепление a‑1,4-гликозидных связей в субстрате путем b‑эли­минирования. При b‑элиминировании происходит удаление ато­ма водорода от 5‑го углеродного атома (С₅). В результате потери водорода между С₅ и С₄ образуется двойная связь (рис.37).

Продукты элиминативного расщепления содержат двойные связи и карбоксильные группы. Они активно поглощают ультрафиолетовый свет с длиной волны 235 нм, а также дают цветную реакцию с тиобарбитуровой кислотой с максимумом поглощения при 547‑550 нм.

Пектинтрансэлиминазы действуют как на пектин, так и пектовую кислоту. Гликозидные связи неэтерифицированных и низкоэтерифицированных субстратов расщепляются ПТЛ неупорядоченно, с предпочтительным разрывом внутренних связей в полимерах и путем последовательного отщепления с восстанавливающих концов ненасыщенных димеров и тримеров.

α -1,4- связь

Рис.37. Элиминативный путь расщепления пектиновых веществ

У микроорганизмов найдены внеклеточные ПТЛ, расположенные в периплазматическом пространстве, и цитоплазматические ПТЛ.

Отличительной особенностью пектолитических лиаз является их потребность в ионах кальция для активации и других двухвалентных катионов.

Различаются лиазы эндо- и экзодействия.

Эндополигалактуронатлиазы (эндопектатлиазы, КФ 4.2.2.2) (эндо-ПГЛ) синтезируются грибами и бактериями. Встречаются как конститутивные ферменты, так и индуцируемые ферменты, синтез которых происходит лишь на средах с пектином или пектатами.

Хорошими субстратами для эндополигалактуронатлиазы являются пектаты, а для ферментов из Arthrobacter и Bacillus polymyxa — пектины со степенями этерификации соответственно 21, 44, 26%. Эндопектатлиазы по способу расщепления D‑га­лактуронана и олигогалатуронидов делят на две группы. Первая группа эндопектатлиаз расщепляет тетрамер по центральной связи и способна также расщеплять трисахариды. В результате воздействия образуется ненасыщенный димер О‑(4‑дезокси-b-L-треогексозо-4-енопиранозил‑L‑1,4)-D-галактопирануроновая кислота. При расщеплении ненасыщенного трисахарида образуется ненасыщенный дисахарид и 4-дезокси-L-треогексозо-5-уроновая кислота.

Лиазы второй группы расщепляют в тетрамере третью связь от восстанавливающего конца, при этом образуется ненасыщенный тример.

Эндопектатлиазы первой группы обнаружены у бактерий Erwinia corotovora, Bacillus polymixa, Xanthomonas campestris, а второй группы — у анаэробной бактерии Bacillus sp.

При действии эндополигалактуронатлиаз вязкость субстратных растворов снижается пропорционально числу разрушенных гликозидных связей. С уменьшением длины цепи олигогалактуронатных субстратов падает активность эндополигалактуронатлиаз.

Экзополигалактуронатлиазы (экзопектатлиазы, КФ 4.2.2.9) (экзо-ПГЛ) отщепляют остатки ненасыщенной олигогалактуроновой кислоты от восстанавливающего конца субстратной цепи. Продукт реакции — ненасыщенный димер (дигалактуроновая кислота). Исключением является фермент из Streptomyces nitrosporeus, который образует тригалактуроновую кислоту.

Оптимальные значения рН для экзо-ПГЛ находятся в пределах 8,0‑9,5. Сродство экзополигалактуронатлиаз к полигалактуроновой кислоте и олигогалактуронатам почти одинаково. Двухвалентные катионы активируют экзополигалактуронатлиазы.

При изучении ферментов из Clostridium multifermentans было показано наличие в неочищенном ферменте пектинэстеразы. Лиаза и пектинэстераза в комплексе расщепляют молекулу пектина. Цепь полисахарида последовательно взаимодействует сначала с активным центром эстеразы, затем с активным центром лиазы без промежуточной диссоциации. При этом образование карбоксильных групп и ненасыщенных димеров идет в отношении 2:1.

Олигогалактуронатлиазы (КФ 4.2.2.6) (ОГЛ) являются внутриклеточными ферментами, которые синтезируются рядом микроорганизмов, в том числе Erwinia carotovora, Erwinia aroideae, Pseudomonas sp. Они катализируют расщепление первой гликозидной связи от восстанавливающего конца у насыщенных и ненасыщенных олигогалактоуронидов, образующихся при действии ПТЛ и ПГ. Из ненасыщенных олигогалактуронатов формируются только ненасыщенные мономеры, а при действии ОГЛ на насыщенные олигогалакуронаты — насыщенные мономеры и отдельные молекулы D‑галактуроновой кислоты.

Олигогалактуронатлиаза из Erwinia aroideae с большей скоростью расщепляет ненасыщенные олигоурониды, чем насыщенные. Максимальную активность наблюдали при рН 7,0.

С одинаковой скоростью расщепляет ненасыщенные и насыщенные олигоурониды олигогалактуронатлиаза из Pseudomonas sp. При этом Са⁺⁺ стимулирует активность, максимальная активность наблюдается при рН 6,4.

Эндополиметилгалактуронатлиазы (пектинлиазы, КФ 4.2.2.10) продуцируются грибами. Они расщепляют высокоэтерифицированные пектины путем неупорядоченного действия с образованием насыщенных олиго-D-галактуронатов. Полигалактуроновая кислота этими ферментами не гидролизуется. Активность полиметилгалактуронатлиаз быстро падает с уменьшением длины цепи. Субстратами с наименьшей длиной цепи, которые гидролизуются ферментами из Aspergillus fonsecalus и Aspergillus niger, являются соответственно тетраметилтетрагалактуронат и триметилтригалактуронат.

Кальций не относится к числу необходимых соединений для активации этих ферментов. Однако ионы кальция и ряда двухвалентных металлов влияют на зависимость активности фермента от рН и степени этерификации субстрата.