Лабораторная диагностика ботулизма

1. Экспресс-метод – постановка ИФА или РПГА с эритроцитарным антительным антитоксическим диагностикумом с целью быстрого обнаружения экзотоксина в крови больного или исследуемом материале.

2. Биологический метод (реакция нейтрализации токсина антитоксином in vivo, биопроба) позволяет обнаружить экзотоксин в материале (остатки пищи, рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, кровь, секционный материал – печень, кишечник, желудок). Мышам внутрибрюшинно вводят фильтрат материала в смеси с поливалентной противоботулинической сывороткой А, В, Е. Другая группа мышей получает материал без сыворотки. В том случае, когда животные второй группы погибают, ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа экзотоксина.

3. Бактериологический метод. Материал засевают на среду Китта-Тароцци, далее производят пересев в высокий столбик сахарного агара, а затем идентифицируют культуру. В реакции нейтрализации определяют экзотоксин. Токсигенность культуры может быть подтверждена при помощи ПЦР.

Лечение и профилактика

Больным с ранними признаками ботулизма, а также лицам, принимавшим зараженную пищу, вводят гетерологичную противоботулиническую антитоксическую сыворотку. Когда неизвестен серовар токсина, вводят поливалентную сыворотку против токсинов А, В, С, Е, а после определения типа экзотоксина – соответствующую моновалентную.

Комплексное лечение ботулизма включает промывание желудка и другие методы детоксикации, инфузионную терапию, при необходимости выполняется искусственная вентиляция легких.

Для специфической профилактики возможно применение анатоксинов типов А, В, Е, в том числе в составе ряда ассоциированных вакцин.

 

Вибрионы

В настоящее время семейство Vibrionaceae включает 8 родов бактерий. Основные патогенные представители относятся к роду Vibrio

Ведущую роль в патологии человека играет возбудитель холеры V. сholerae.

V. рarahaemolyticus является причиной диарейных инфекций, V. vulnificus иногда способен вызывать раневую инфекцию и септицемию.

По морфологии возбудители представляют собой изогнутые подвижные палочки размерами 2-4 мкм. Спор не образуют.

Вибрионы распространены повсеместно: обитают в морской и пресной воде, часто колонизируют организмы водных животных (амфибий, ракообразных, рыб и др.)

Температурный оптимум для многих видов 37°С (некоторые возбудители, обитающие в морской воде, лучше размножаются при температуре 25°С и ниже).

При культивировании вибрионов в среду вносят 2-3% раствор NaCl (галотолерантные микроорганизмы).

Данные бактерии – хемоорганотрофы с окислительным и бродильным типом метаболизма.

Ферментируют глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты, иногда газа. Оксидазоположительны.

Холерные вибрионы представляют собой изогнутые палочки размерами 2-4 мкм, имеют один или два полярных жгутика. Вибрионы весьма подвижны.

Спор не имеют. Продуцируют экзополисахарид, который участвует в формировании микробной биопленки. Представители серогруппы О139 образуют капсулу.

Бактерии обладают полиморфизмом. Типичный возбудитель в форме «запятой» обычно наблюдают в образцах клинического материала. В мазках из колоний преобладают палочковидные возбудители. Иногда возникают нитевидные, кокковидные, булавовидные формы. Под действием пенициллина могут превращаться в L-формы.

Хорошо окрашиваются многими анилиновыми красителями, грамотрицательны.

Культуральные свойства

Растут на простых питательных средах в температурном диапазоне 16-40°С, оптимум – 37°С, селективными являются щелочные среды с рН 7,6-9,0.

На жидких средах вызывает помутнение и образование нежной голубоватой пленки на поверхности. На 1% щелочной пептонной воде (рН 8,8-9,0) растут быстро, помутнение и пленка появляется через 6-8 часов.

На твердых средах (щелочной агар) образуют мелкие, прозрачные, с ровными краями, голубоватые в проходящем свете колонии.

На агаре с тиосульфатом, цитратом, солями жёлчных кислот, сахарозой и индикатором бромтимоловым синим (ТЦБС-агар) образуют желтые колонии на фоне голубовато-серой среды. На среде Монсура (щелочной таурохолат-теллурит-желатиновый агар) растут в виде серо-черных колоний.

Биохимические свойства

Факультативный анаэробы с более выраженными аэробными свойствами.

Холерные вибрионы биохимически весьма активны. Ферментируют с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, маннит, крахмал, не разлагают лактозу. По отношению к трем углеводам – маннозе, сахарозе и арабинозе – все вибрионы разделяют на 8 групп по Хейбергу.

Холерные вибрионы разлагают маннозу и сахарозу, не разлагают арабинозу и принадлежат к 1 группе Хейберга.

Проявляют протеолитическую активность: разжижают желатину в виде воронки, гидролизуют казеин. Обладают плазмокоагулирующим и фибринолитическим действием. Свертывают молоко, разлагают белки до индола и аммиака. Восстанавливают нитраты в нитриты.

На основании биологических различий холерные вибрионы разделяют на 2 биовара: классический и Эль-Тор. Особенностью вибриона Эль-Тор является способность гемолизировать эритроциты, в связи с чем его относят к гемолитическим вибрионам.

Антигенная структура

У холерных вибрионов есть термостабильный О-антиген и термолабильный жгутиковый Н-антиген. Жгутиковый Н-АГ является общим.

По структуре О-АГ выделяют до 200 серогрупп. Оба биовара возбудителей холеры относятся к серогруппе О1.

Было установлено, что О1-АГ неоднороден и состоит из трех субъединиц: А, В, С, по которым различают серовары АВ – Огава, АС – Инаба и АВС – Гикошима. Эти свойства являются эпидемиологическими маркерами данных возбудителей.

Представители серогруппы О139 не агглютинируются О1-сыворотками. Данный вариант произошел от биовара Эль-Тор.

Его возникновение обусловлено генетическими механизмами. В результате рекомбинации возбудитель приобрел группу генов, кодирующих новый вариант ЛПС клеточной стенки совместно с полисахаридом капсулы.

Значительные изменения в строении поверхностных АГ обеспечили «ускользание» бактерий серогруппы О139 от действия факторов иммунитета, направленных к другим возбудителям холеры.

Другие вибрионы, которые также не агглютинируются О1-сывороткой, обозначаются как НАГ-вибрионы (или неагглютинирующиеся). Они способны вызывать самостоятельные диарейные заболевания.

Факторы вирулентности

Возбудитель содержит многочисленные адгезины и факторы колонизации. К ним относятся гемагглютинин и различные виды пилей.

Экзополисахарид вибрионов выполняет защитную функцию и обеспечивает образование биопленки.

Основную роль в патогенезе холеры играет экзотоксин (или холероген) – термолабильный белок, устойчив к действию протеолитических ферментов, разрушается фенолом и формалином. По механизму действия представляет собой энтеротоксин.

Молекула экзотоксина состоит из 2 компонентов (А и В) общей молекулярной массой 84 кД.

Рецепторный компонент В имеет 5 субъединиц. Он взаимодействует с G_М1-ганглиозидным рецептором на энтероцитах и обеспечивает проникновение в клетку токсического компонента А. В клетке происходит восстановление компонента А с образованием субъединицы А₁, которая катализирует рибозилирование клеточного G-белка.

В результате активируется аденилатциклаза, и происходит повышение уровня цАМФ в энтероцитах. Это приводит к активной секреции ионов хлора и бикарбонатов, подавлению всасывания ионов натрия, хлора и воды, выходу жидкости и электролитов из железистых клеток в просвет кишечника с развитием тяжелой диареи.

Образование токсина определяется ctx-генами трансдуцирующего CTXφ -бактериофага. Попадание фага CTXφ в холерный вибрион и его интеграция в геном приводят к лизогенной конверсии возбудителя, и вибрион получает способность к синтезу холерного токсина.

Однако успешная трансдукция фага в бактерии возможна только при наличии у вибрионов особых рецепторных пилей. Они способны специфически связывать CTX-фаг, обеспечивая его проникновение в клетку.

Рецепторные пили кодируются генами отдельного генетического островка патогенности VPI. Предполагается, что данный островок патогенности попадает в холерный вибрион в результате трансдукции еще одного специфического фага VPIφ.

Ферменты агрессии и инвазии гиалуронидаза и нейраминидаза разжижают слизь, облегчают доступ бактерий к эпителию, обеспечивают взаимодействие с микроворсинками.

Полисахарид капсулы бактерий серогруппы О139 защищает от фагоцитоза и предохраняет от действия АТ и комплемента.

Резистентность

Холерные вибрионы устойчивы к низким температурам – во льду жизнеспособны до 1 месяца. В морской воде сохраняются до 1,5-2 месяцев, в речной – до нескольких недель, в почве – до 3 месяцев, в фекалиях – до 3 суток. В вареных продуктах, молоке и молочных продуктах, сырых овощах жизнеспособны 2-5 дней, на фруктах – 1-2 дня.

Вибрионы обладают слабой резистентностью к действию повышенной температуры. При 80°С погибают через 5 мин, при 100°С – мгновенно. Холерные вибрионы высокочувствительны к высушиванию, ультрафиолетовому облучению, хлорсодержащим препаратам; все вибрионы высокочувствительны к кислотам.